Isolamento primário de células acinares: um método para isolar células acinares do pâncreas de camundongos

- Uma célula acinar pancreática é uma célula exócrina que contém uma variedade de enzimas digestivas. Às vezes, em resposta à sinalização oncogênica, a célula acinar se converte em uma célula ductal. Esta célula ductal pode mais tarde se tornar cancerosa. Portanto, é vital isolar as células acinares para estudar seu papel na progressão do câncer de pâncreas.

Comece isolando o pâncreas de um camundongo sacrificado. Adicione o pâncreas a um recipiente de pesagem contendo uma solução salina balanceada suplementada com um antibiótico. Pique o pâncreas em pedaços pequenos usando uma tesoura e adicione o tecido pancreático a um tubo. Em seguida, adicione a solução de colagenase aos pedaços do pâncreas no tubo.

A colagenase digere o colágeno que mantém o tecido unido, de modo que o tecido se quebre em pedaços finos. Agora, adicione meios contendo soro ao tubo e coloque o tecido no gelo. Isso ajuda a interromper a ação da colagenase.

Filtrar o tecido e o meio duas vezes, diminuindo progressivamente o tamanho da malha do filtro de cada vez para obter uma suspensão de tecido fino. Por fim, centrifugue a suspensão resultante para coletar as células acinares do pellet. Remova o sobrenadante e armazene as células acinares para análise posterior. No protocolo a seguir, isolaremos células acinares do pâncreas de um camundongo sacrificado.

- Para dissecar o pâncreas de um camundongo sacrificado, primeiro prenda as patas do camundongo na tampa de poliestireno, orientando-a de forma que a cauda fique voltada para o pesquisador, e borrife o abdômen com etanol 70%. Use uma pinça autoclavada para levantar o pelo e a pele na linha média e, com uma tesoura autoclavada, faça uma incisão no pelo e na pele da abertura uretral até a área da caixa torácica do diafragma. Faça incisões adicionais à esquerda e à direita para cortar o pelo e a pele, criando uma visão clara da cavidade abdominal.

Em seguida, corte o revestimento peritoneal no meio e à direita e à esquerda e puxe-o para longe dos órgãos. Use a pinça para levantar os intestinos e movê-los para o lado esquerdo do camundongo, criando espaço para ver o pâncreas rosa claro preso ao baço oval vermelho escuro. O tecido pancreático terá textura macia e esponjosa. Corte o pâncreas, que corre ao longo do estômago, entrelaçando-se com os intestinos.

Separe o baço do pâncreas e coloque o pâncreas em um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de HBSS com 1X penicilina-estreptomicina e transfira para a capela de fluxo laminar. Despeje o conteúdo do tubo em um barco de pesagem vazio e use uma pinça para lavar o pâncreas girando-o. Em seguida, use a pinça para mover o pâncreas para um segundo recipiente de pesagem contendo HBSS com penicilina-estreptomicina e lave novamente girando.

Mova o pâncreas para o terceiro barco de pesagem contendo HBSS com penicilina-estreptomicina e comece a cortar o pâncreas em pedaços de 5 milímetros ou menores. Para despejar o conteúdo do barco de pesagem em um tubo novo de 50 mililitros, primeiro use a pinça para mover os pedaços do pâncreas para o líquido enquanto o barco está sendo inclinado. Quando as peças não estiverem mais presas ao barco, despeje seu conteúdo no tubo. Pegue as peças restantes com a pinça e lave a pinça no tubo.

Depois de centrifugar o tubo a 931 vezes a gravidade a 4 graus Celsius por dois minutos, use uma pipeta de 5 mililitros para remover o HBSS e qualquer gordura flutuante. Adicione 5 mililitros de colagenase diluída em HBSS. Feche o tubo e certifique-se de uma tampa selada envolvendo o tubo em filme plástico de parafina. Coloque-o em uma incubadora, agitando a 220 RPM a 37 graus Celsius por 20 minutos, o que produzirá uma solução turva e alguns pedaços de tecido restantes.

Para interromper a dissociação, coloque o tubo no gelo e adicione 5 mililitros de HBSS frio com 5% de FBS. Depois de centrifugar a 931 vezes a gravidade a 4 graus Celsius por dois minutos, remova o sobrenadante usando uma pipeta de 5 mililitros. Ressuspenda o pellet em 10 mililitros de HBSS com 5% de FBS e centrifugue novamente a 931 vezes a gravidade por dois minutos a 4 graus Celsius.

Remova o sobrenadante usando uma pipeta de 5 mililitros e repita esta etapa com mais 10 mililitros de HBSS com 5% de FBS. Em seguida, ressuspenda o pellet em 5 mililitros de HBSS com 5% de FBS. Use uma pipeta P1000 para filtrar a suspensão celular 1 mililitro de cada vez através de uma malha de 500 micrômetros em um tubo de 50 mililitros.

Para lavar as células pancreáticas restantes através da malha, adicione mais 5 mililitros de HBSS com 5% de FBS. Em seguida, use uma pipeta P1000 para passar este filtrado 1 mililitro de cada vez através da malha de 105 micrômetros para um tubo de 50 mililitros. Pipete suavemente esta suspensão celular em um tubo de 50 mililitros contendo HBSS com 30% de FBS, que formará uma camada de suspensão celular na parte superior.

Centrifugue esta suspensão celular a 233 vezes a gravidade a 4 graus Celsius por dois minutos e remova o sobrenadante. Ressuspenda o pellet contendo as células acinares no meio completo do Waymouth 1X.