Isolamento de ilhotas pancreáticas por meio de perfusão de colagenase: um método enzimático para isolar células de ilhotas pancreáticas

- As células das ilhotas no pâncreas produzem hormônios essenciais envolvidos nas funções endócrinas. Para isolar ilhotas, primeiro, prenda um camundongo sacrificado e exponha cirurgicamente sua cavidade abdominal. Escove o fígado e os intestinos para localizar e prender o ducto biliar comum. Identifique a ampola de Vater, o ducto formado pela união dos ductos biliares pancreático e comum.

Em seguida, injete uma solução de enzima colagenase no ducto biliar comum. O refluxo do ducto infla com sucesso o pâncreas, facilitando a dissociação dos tecidos pancreáticos induzida pela colagenase. Extirpar o pâncreas num tubo contendo mais solução de colagenase. Pique mecanicamente o tecido e incube para ajudar na digestão do tecido pela colagenase.

Depois de obter uma suspensão homogênea, interrompa a digestão enzimática adicionando uma solução contendo proteínas que inibem a atividade da colagenase. Centrifugue para coletar um grânulo de tecido. Ressuspenda o pellet em um meio de gradiente de densidade apropriado, coloque um tampão adequado sobre ele e centrifugue para gerar camadas de gradiente.

Colete ilhotas da camada formada entre o meio de gradiente de densidade e o buffer. Finalmente, escolha ilhotas saudáveis para cultivar. No protocolo a seguir, demonstraremos o isolamento das ilhotas pancreáticas murinas por administração de colagenase seguida de centrifugação com gradiente de densidade.

- Comece gravando os membros do camundongo em decúbito dorsal e borrifando o corpo com etanol a 70%. Usando uma pinça de vidro de cobertura e uma tesoura cirúrgica curva, faça uma incisão horizontal na pele abdominal de aproximadamente 3 centímetros e abra a pele para expor a parede abdominal. Faça uma incisão vertical de 3 a 4 centímetros no peritônio abdominal para expor totalmente o pâncreas e coloque o camundongo sob um microscópio de dissecação.

Empurre o lobo do fígado superiormente para expor o ducto biliar, que aparece como um tubo rosa pálido, e mova suavemente os intestinos da região lombar e ilíaca direita para a direita da cavidade abdominal para expor o ducto biliar e a artéria hepática. Use Schwartz Micro Serrefines para pinçar cuidadosamente o ducto colédoco o mais próximo possível do fígado e identificar a ampola de Vater, que está localizada na papila duodenal e formada pela união do ducto pancreático e do ducto colédoco.

Usando uma pinça Micro Adson para esticar o ducto colédoco, insira uma agulha de calibre 30 de meia polegada presa a uma seringa de 3 mililitros contendo 3 mililitros de solução de colagenase P recém-preparada na ampola de Vater, empurrando a agulha para dentro do duto paralelo ao vaso por cerca de um quarto do comprimento do vaso. Assim que a agulha estiver no lugar, estabilize a agulha com uma pinça Micro Adson e injete lenta e firmemente 3 mililitros de solução de colagenase P no duto. A injeção é considerada bem-sucedida se as regiões da cabeça, pescoço, corpo e cauda do pâncreas estiverem totalmente infladas.

- A entrada adequada na ampola e a canulação do ducto colédoco são essenciais para uma colheita de digestão bem-sucedida. A perfuração das paredes ductais reduz a eficácia do isolamento.

- Usando uma pinça curva e Micro Adson, puxe cuidadosamente o pâncreas inflado começando no baço e continuando em direção ao estômago e ao longo do duodeno. Em seguida, coloque o pâncreas em um tubo de digestão de 50 mililitros contendo 3 mililitros de solução gelada de colagenase P. Para colher as ilhotas, primeiro, use uma tesoura cirúrgica fina para cortar o pâncreas por 3 a 5 segundos antes de colocar o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius a 100 a 120 rotações por minuto por 12 a 13 minutos.

No final da incubação, agite suavemente o tubo por cerca de 30 segundos para romper o tecido até que a solução fique homogênea, conforme confirmado por partículas finas de tecido pancreático semelhantes a areia. Assim que o tecido for digerido, coloque o tubo no gelo e adicione 40 mililitros de solução de parada gelada para encerrar a reação enzimática. Depois de interromper suavemente o pellet, gire o tecido digestivo em uma centrífuga de balde oscilante, seguida de duas centrifugações com 20 mililitros de solução de parada fresca por lavagem.

Após a última lavagem, ressuspenda o pellet em 40 mililitros de HBSS gelado por três lavagens adicionais, ressuspendendo o pellet em 5 mililitros de solução de gradiente de densidade à temperatura ambiente após a última lavagem. Vortex o tubo brevemente em baixa velocidade até que a solução esteja homogeneizada antes de adicionar mais 5 mililitros de gradiente de densidade de temperatura ambiente ao tubo. Agora use uma pipeta de 10 milímetros para adicionar suave e lentamente 10 milímetros de HBSS à temperatura ambiente ao tubo de maneira gota a gota para permitir a formação de um gradiente e use uma centrífuga de balde oscilante para isolar as populações de células por separação de gradiente de densidade.

No final da centrifugação, use uma pipeta de 10 mililitros, pré-umedecida com HBSS frio para coletar 5 a 10 mililitros da camada de ilhotas entre o gradiente de densidade e o HBSS. Transfira as ilhotas para um novo tubo de 50 mililitros contendo 20 mililitros de HBSS fresco e gelado e colete as células por centrifugação em uma centrífuga de balde oscilante. Aspire cuidadosamente todos, exceto os últimos 3 mililitros do sobrenadante, sem perturbar o pellet, e lave as ilhotas pelo menos mais três vezes com 20 mililitros de HBSS fresco por lavagem.

Após a última lavagem, substitua o sobrenadante por 4 mililitros de meio RPMI 1640 de 37 graus Celsius e gire suavemente o tubo para desalojar o pellet. Despeje imediatamente as ilhotas em uma placa de Petri de 100 milímetros e lave o tubo com 5 mililitros de meio RPMI 1640 fresco para coletar as ilhotas restantes, agrupando a lavagem com as outras ilhotas.

Em seguida, use um microscópio de dissecção e uma ponta de pipeta de 20 microlitros para escolher ilhotas esféricas ou oblongas, marrom-douradas, saudáveis, com uma superfície lisa da placa de Petri para transferir para uma nova placa de Petri contendo 10 mililitros de meio RPMI 1640 completo. Quando todas as ilhotas tiverem sido coletadas, coloque-as na incubadora estéril a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em ar umidificado durante a noite.