Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 5:39 min. • April 30th, 2023
- As células cancerígenas pancreáticas interagem com fibroblastos associados ao câncer no microambiente tumoral ou TME. Essas interações modulam a atividade metabólica das células cancerígenas e afetam a progressão do câncer.
Os esferoides são os agregados celulares que recapitulam o TME in vitro. Portanto, podemos usar esses esferoides para testar as alterações nas funções metabólicas do tumor por ensaio de fluxo extracelular. Este ensaio mede a concentração extracelular de oxigênio e prótons para determinar o metabolismo aeróbico e glicolítico, respectivamente.
Comece tomando esferóides 3D de tamanho apropriado feitos pela co-cultura de células cancerígenas pancreáticas com fibroblastos pancreáticos. Agora, transfira os esferóides para uma placa de análise de fluxo e cubra-a com um cartucho sensor contendo drogas de teste. Execute o ensaio em um analisador de fluxo extracelular.
O analisador de fluxo injeta pneumaticamente os medicamentos de teste do cartucho do sensor para a placa de análise em pontos de tempo específicos. Em resposta às drogas de teste, as células liberam prótons e oxigênio na microcâmara da placa e os fluoróforos presentes na sonda do sensor medem esses níveis. Finalmente, usando um software apropriado, analise a funcionalidade dos esferoides.
No protocolo a seguir, demonstraremos um método para medir a função metabólica das células tumorais pancreáticas presentes em esferoides 3D usando o ensaio de fluxo extracelular.
No dia anterior ao ensaio metabólico, hidrate o cartucho da sonda com 200 microlitros de calibrante de ensaio por poço na placa de utilidade fornecida e incube a placa de utilidade durante a noite em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius sem CO2.
Na manhã seguinte, observe os esferóides na placa de crescimento sob um microscópio óptico para verificar sua morfologia e uniformidade geral. Transfira a placa de crescimento para uma unidade de retenção magnética e aspire cuidadosamente aproximadamente 120 microlitros de meio de crescimento por poço.
Lave suavemente os esferóides com 120 microlitros de meio de ensaio aquecido três vezes. Após a última lavagem, inspecione os esferoides ao microscópio novamente para confirmar se os esferoides não foram lavados e adicione 180 microlitros de meio de ensaio quente a cada poço.
Use uma ponta larga e furada para aspirar cuidadosamente um único esferóide pré-lavado da placa de crescimento repelente de células e transfira suavemente o esferóide diretamente para o centro de um poço de uma placa de ensaio esferóide, permitindo que o esferóide caia na microcâmara central do poço por gravidade.
Quando todos os esferoides tiverem sido transferidos, coloque a placa de ensaio na incubadora de ar umidificado sem CO2, a 37 graus Celsius por uma hora. Durante a incubação, oriente o cartucho do sensor de modo que as linhas A a H fiquem do lado esquerdo e coloque uma guia de carregamento na parte superior do cartucho de forma que a letra correspondente à porta a ser carregada fique no canto superior esquerdo.
Se a placa tiver sido carregada uniformemente, abra o software de análise e clique em Modelos. Clique duas vezes em Modelo em branco e clique em Gerar grupos. Na guia Mapa de placas, atribua grupos à placa de ensaio correspondente ao experimento
Na guia Protocolo do instrumento, marque Calibrar, Equilibrar e Ciclo de medições de linha de base. Clique em Injeções e defina o composto para cada porta. Altere os ciclos de medição para 6. Revise o resumo do protocolo e do grupo e, em seguida, salve o modelo de design do ensaio.
Com base no design do ensaio como guia, use uma pipeta multicanal para dispensar cada reagente diretamente nas portas de injeção, mantendo as guias de carregamento no lugar com a ponta dos dedos. Quando todos os reagentes tiverem sido carregados, remova a guia de carregamento e segure o cartucho ao nível dos olhos para inspecionar visualmente as portas de injeção para um carregamento uniforme.
Transfira o cartucho e a placa de utilidade para o analisador de fluxo extracelular e inicie a calibração pré-ensaio. Uma vez calibrado, substitua a placa de utilidade pela placa de ensaio pré-aquecida contendo os esferóides 3D e inicie o ensaio. Quando o ensaio estiver concluído, exporte os dados para o software de análise de dados apropriado.