Modelo de camundongo ortotópico fluorescente: implantando células cancerígenas que expressam GFP em camundongos para avaliar a progressão do tumor in vivo

- As células cancerígenas que expressam proteína fluorescente verde ou GFP permitem monitorar o crescimento e a metástase do tumor por imagens ópticas não invasivas. Geralmente implantamos essas células em um modelo ortotópico, que permite a recriação do microambiente tumoral e mimetiza a interação das células tumorais com seu entorno.

Comece colocando um mouse anestesiado em uma almofada de aquecimento quente. Agora, insira o nariz em uma máscara nasal para fornecer oxigênio e isoflurano, um anestésico. Usando uma tesoura, faça uma pequena incisão e corte o tecido. Puxe suavemente o baço junto com o pâncreas e localize a cauda pancreática.

Carregue uma seringa com suspensão de células cancerígenas fluorescentes e injete-a suavemente na cauda pancreática. Uma bolha superficial aparece no local injetado, confirmando o implante bem-sucedido. Coloque os órgãos de volta na cavidade do corpo e use uma sutura estéril para fechar a incisão. Agora, retorne o mouse para uma gaiola e monitore-o até a recuperação.

Após a duração desejada, coloque o mouse em uma câmara de imagem e tire as imagens. O feixe de luz atinge as células cancerígenas e excita a GFP, que, por sua vez, produz uma fluorescência verde. No protocolo a seguir, realizaremos o implante cirúrgico de células cancerígenas pancreáticas que expressam GFP em um modelo ortotópico de camundongo murino.

Para implantar as células, primeiro aplique pomada nos olhos de um camundongo anestesiado e coloque o animal em uma almofada de aquecimento coberta com uma cortina estéril. Em seguida, desinfete suavemente o flanco do animal com três esfoliantes de iodo seguidos de três enxágues com etanol a 70%. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, carregue aproximadamente 200 microlitros das células preparadas em uma seringa TB pré-resfriada de 1 mililitro equipada com uma agulha de calibre 18

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Substitua a agulha de calibre 18 por uma agulha de calibre 27 e coloque as células de volta no gelo. Em seguida, localize a área geral do baço no quadrante superior esquerdo do abdômen. Usando uma pinça, aperte a pele acima do baço e faça uma incisão de aproximadamente 1 centímetro para criar uma bolsa. Em seguida, aperte o músculo liso no topo do baço e corte o tecido para acessar a cavidade peritoneal.

Em seguida, agarre suavemente a extremidade caudal do baço e puxe-a para fora da cavidade corporal. Usando um cotonete estéril úmido, espalhe o pâncreas preso ao final do baço para localizar a cauda pancreática. Entregue 50 microlitros das células na cauda pancreática. Em seguida, gire lentamente a agulha para fora do pâncreas.

Uma implantação bem-sucedida parecerá uma bolha superficial sem vazamentos. Retorne os órgãos para a cavidade peritoneal e envolva tudo com o músculo e a pele. Em seguida, use uma sutura 6-0 para fechar a incisão. Depois, injete cetoprofeno nos animais e monitore-os até que estejam totalmente recuperados. No momento experimental apropriado, use um sistema comercial de imagem de pequenos animais para obter imagens do crescimento do tumor no animal vivo sob anestesia e selecione os filtros de excitação e emissão apropriados.

Em seguida, obtenha uma imagem inicial usando apenas luz branca. Mantendo o animal na mesma posição, mude para os filtros GFP e adquira uma segunda imagem. Para analisar o crescimento tumoral, sobreponha as imagens brancas e fluorescentes para avaliar a área fluorescente e a intensidade das células tumorais.