JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 3:14 min • April 30th, 2023
- As células-tronco do câncer de pâncreas ou CSCs são um subconjunto de células cancerígenas auto-renováveis e podem dar origem a todo o tumor. As CSCs residem em um nicho bem protegido que consiste em outras células, como fibroblastos, células imunológicas, células endoteliais e componentes da matriz extracelular, como citocinas e fatores de crescimento. As interações que acontecem entre as células em tal ambiente ajudam as CSCs a se propagar e aumentar o crescimento do tumor.
Para estudar as propriedades das CSCs, nós as isolamos dos tumores pancreáticos. Comece tomando a suspensão celular do tecido tumoral pancreático humano em um meio de crescimento CSC. Em seguida, semeie a suspensão, consistindo principalmente de fibroblastos e CSCs, em uma placa revestida de gelatina e incube-a pela duração desejada. Os fibroblastos aderem à superfície da gelatina, deixando as CSCs flutuantes na suspensão celular.
Pegue uma pequena quantidade de suspensão celular e adicione azul de tripano. Pipete esta mistura para um hemocitômetro e conte o número de células viáveis. O azul de tripano entra nas células mortas e as mancha de azul, deixando as células vivas incolores. Por fim, armazene os CSCs para análise posterior.
No protocolo a seguir, isolaremos as CSCs dos tumores pancreáticos.
- Para isolar células-tronco cancerígenas de um adenocarcinoma ductal pancreático em um gabinete de biossegurança estéril, use um bisturi estéril e uma pinça para picar o tumor humano em uma placa de cultura de 60 x 15 milímetros contendo um mililitro de PBS estéril, adicionando mais três a quatro mililitros de PBS conforme necessário, até que o tecido esteja completamente dissociado.
Transfira a suspensão de tecido para um tubo cônico estéril e adicione PBS a um volume final de cinco mililitros. Em seguida, homogeneizar mecanicamente a amostra com o dissociador, centrifugar e digerir o tecido homogeneizado com colagenase a 37 graus Celsius.
Após uma hora, centrifugue as células, ressuspendendo o pellet em 10 mililitros de meio completo. Filtre a suspensão celular através de um filtro de 40 micrômetros e gire as células novamente, desta vez ressuspendendo o pellet em cinco mililitros de ACK.
Após cinco minutos à temperatura ambiente, remova o tampão de lise dos glóbulos vermelhos por centrifugação e ressuspenda o pellet em meio de células-tronco cancerígenas. Em seguida, incube as células em um prato revestido de gelatina a 37 graus Celsius para remover a maioria das células de fibroblastos que se ligam rapidamente. Após uma hora, recupere o sobrenadante e quantifique o número de células cancerígenas pancreáticas viáveis.