JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 4:24 min • April 30th, 2023
- O gânglio da raiz dorsal ou DRG são neurônios sensoriais que transmitem mensagens da periferia para o sistema nervoso central. Em contraste, os neurônios do plexo mioentérico estão envolvidos nos movimentos peristálticos dos intestinos.
Em condições de câncer, como o câncer de pâncreas, esses neurônios se alteram morfologicamente e funcionalmente. Para estudar as mudanças na morfologia neuronal, semeie as células neurais em lamínulas pré-revestidas com proteína laminina, colocadas em uma placa multipoços, e cubra as células com o meio basal neural.
A proteína laminina promove o crescimento de neuritos. Incube as células durante a noite. Em seguida, adicione o meio de extrato de tecido de câncer de pâncreas aos três primeiros poços e o meio de extrato de tecido pancreático saudável aos três poços subsequentes. Incube a placa. Agora, execute a coloração imuno-histoquímica usando marcadores de anticorpos específicos para neurônios, que se ligam aos neurônios. Coloque a lamínula na lâmina de vidro e coloque-a sob um microscópio invertido. Meça a densidade de neuritos usando o software.
Os neurônios DRG cultivados no extrato de tecido de câncer de pâncreas geralmente apresentam maior densidade de neuritos do que no extrato de tecido pancreático saudável. Em contraste, os neurônios do plexo mioentérico formam neuritos mais longos do que em extratos de tecido pancreático saudável. No protocolo a seguir, realizaremos um ensaio de neuroplasticidade in vitro no DRG de um camundongo recém-nascido e nos neurônios do plexo mioentérico.
- Para preparar as células para a cultura, use um hemocitômetro para estimar o número total de neurônios e glia. Em seguida, semeie as células em lamínulas pré-revestidas de 13 milímetros em uma placa de 24 poços. O revestimento utilizado depende dos objetivos experimentais. Em seguida, cubra os poços com meio basal neural e permita que as células se liguem aos poços, durante a noite. No dia seguinte, descongele o meio suplementado com extrato de tecido ou o meio suplementado com sobrenadante da linha celular.
Em seguida, aspire o meio de semeadura dos DRGs e faça uma lavagem opcional e muito suave com PBS. Em seguida, pipete lentamente o meio suplementado com extrato de tecido ou o meio suplementado com sobrenadante da linha celular nas células para produzir 100 microgramas por mililitro. Agora, deixe as células crescerem por 48 horas a 37 graus Celsius no extrato de tecido ou no meio fornecido pelo sobrenadante da linha celular. Após 48 horas, aspirar o meio e fixar em paraformaldeído a 4% para imunocoloração.
Para coloração imunofluorescente dupla, use marcadores específicos do neurônio e da glia. Para morfometria, use um microscópio de luz invertida equipado com uma câmera CCD em combinação com software automatizado para medir a densidade de neuritos. Usando ampliação de 200X, meça a densidade de neuritos de culturas neuronais sobrepondo uma grade de 50 X 50 mícrons e contando a densidade de fibras por quadrado, medida nas fibras que se cruzam. Repita esta análise para quatro regiões diferentes de crescimento mais denso em quatro a cinco fotomicrografias representativas em cada lamínula.
Meça o crescimento de neuritos, o número médio de ramos por neurônio, o comprimento médio do ramo e o tamanho pericarional de 30 neurônios solitários selecionados aleatoriamente de cada lamínula, marcando os neuritos e pericarias.