Monitoramento de microambiente tumoral baseado em PTM: um método para rastrear mudanças na rigidez da ECM usando esferoides tumorais

- Na invasão tumoral, as células tumorais periféricas sofrem transição epitelial para mesenquimal ou EMT, resultando na degradação local da matriz extracelular ou MEC. Podemos estudar a interação das células tumorais com a MEC in vitro.

Para estudar essas interações, transfira um esferóide pré-formado derivado de células tumorais pancreáticas para uma placa contendo andaime de colágeno junto com sondas traçadoras fluorescentes incorporadas e meios de cultura. O esferóide tumoral libera proteases, que degradam o colágeno e reduzem a rigidez da MEC, resultando no livre movimento das sondas traçadoras na MEC.

Incube a placa pelo tempo desejado. Observe a amostra sob um microscópio de luz para observar a grade de pontos de amostra no andaime de colágeno e registrar dados de vídeo deles. A região da matriz próxima ao esferóide mostra degradação máxima do colágeno. Portanto, aumentou o movimento da sonda. Em contraste, a área mais distante do esferóide mostra menos degradação do colágeno, resultando em movimento restrito das moléculas da sonda.

Essa técnica de examinar as propriedades reológicas da ECM medindo as trajetórias das partículas traçadoras é conhecida como microrreologia de rastreamento de partículas ou PTM. No protocolo a seguir, realizaremos um ensaio de formação de esferas para identificar células-tronco de câncer de pâncreas e avaliar o efeito da metformina.

Para começar, prepare uma estação de trabalho dentro de uma capela de fluxo laminar com dois frascos de 2 mililitros. O frasco 1 conterá o esferóide tumoral e o frasco 2 será um controle livre de células. Prepare uma mistura diluída de sondas traçadoras fluorescentes de 1 mícron de diâmetro modificadas com carboxilato, adicionando 2 partes de sondas de estoque a 25 partes de água estéril.

Retire uma garrafa de 3,1 miligramas por mililitro de colágeno bovino da geladeira e coloque-a no gelo. Alíquota de 125 microlitros de colágeno seguidos por 50 microlitros de solução de sonda traçadora diluída no frasco 1. Vórtice brevemente para distribuir as sondas.

Em seguida, adicione 235 microlitros de meios de cultura de células apropriados contendo vermelho de fenol para um volume total de 410 microlitros e vórtice brevemente antes de remover 205 microlitros e colocá-lo no frasco 2. Em seguida, adicione aproximadamente 2 microlitros de hidróxido de sódio 1 molar ao frasco 1 para trazer a solução de volta ao pH neutro. Vórtice brevemente para misturar. Em seguida, volte imediatamente para a prateleira de gelo para que a mistura não comece a curar.

Remova cuidadosamente 40 microlitros de meio do poço contendo o esferóide tumoral. Retenha esses 40 microlitros enquanto conduz a próxima etapa. Verifique o poço para ver se o esferóide foi removido na etapa anterior. Caso contrário, coloque os 40 microlitros de volta no poço e repita a etapa anterior.

Se estiver, adicione os 40 microlitros contendo o esferóide ao frasco 1. Mexa suavemente o frasco 1 antes de transferir a mistura em porções de 60 microlitros para três poços separados de uma placa de 96 poços. Inspecione cada poço com um microscópio depois de adicionar a mistura para determinar qual poço contém o esferoide.

Em seguida, adicione aproximadamente 2 microlitros de hidróxido de sódio 1 molar e 40 microlitros de meio de cultura celular ao frasco 2 e vórtice antes de aliquotar 60 microlitros dessa mistura a um poço vazio na placa de 96 poços e rotulá-lo como um controle livre de células. Coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius para curar por pelo menos uma hora.

Para construir uma grade de pontos de amostragem, primeiro transfira a placa de amostra da incubadora para o estágio de microscópio. Aguarde 10 minutos para que a amostra atinja a temperatura ambiente se não estiver disponível uma fase aquecida. Observe a amostra com lentes objetivas de baixa potência para garantir que ela esteja intacta e pronta para a imagem. Determine a posição do tumor dentro do poço e documente isso com uma imagem de luz transmitida para posterior co-registro espacial.

Normalmente, 20 pontos de amostragem em cada poço distribuídos em anéis concêntricos ao redor do esferóide produzirão resultados adequadamente detalhados. Mova a platina para cada posição desejada e use o software de interface do microscópio para registrar as coordenadas x e y.

Mude o microscópio para uma lente objetiva de alta potência e selecione o cubo de filtro apropriado para o comprimento de onda de excitação das sondas traçadoras. Usando a lista de pontos criados, vá para o primeiro ponto na grade. Ajuste o foco para encontrar o fundo do poço antes de subir para encontrar um campo de view contendo várias sondas traçadoras em foco.

Observe o histograma de intensidade e ajuste a intensidade e o tempo de exposição para obter a maior faixa dinâmica possível, garantindo que a imagem não fique saturada. Obtenha uma sequência de vídeo a uma taxa de quadros de 20 a 30 milissegundos por quadro e salve com uma convenção de nomenclatura apropriada. Durante a gravação, não toque no microscópio ou na mesa.

Repita a gravação para cada ponto de amostra na grade. Em seguida, repita o processo para construir uma grade para cada poço no experimento e repita todo o processo para cada ponto de tempo durante o monitoramento longitudinal.

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• EMT - Short for epithelial-to-mesenchymal transition enabling invasion of tumor cells.
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