Avaliação de focos de danos ao DNA: para identificar focos de danos ao DNA induzidos por radiação em linhagens de células cancerígenas usando coloração por imunofluorescência

- A radiação ionizante induz diferentes tipos de danos ao DNA, como quebras de fita simples ou SSBs e quebras de fita dupla ou DSBs. Quebras de fita simples ou SSBs ocorrem quando a radiação danifica as bases e cliva a espinha dorsal do DNA, enquanto quebras de fita dupla, DSBs, se desenvolvem quando dois SSBs ocorrem em fitas de DNA opostas. O primeiro passo da formação do DSB é a fosforilação da histona H2AX, que pode ser visualizada por coloração por imunofluorescência.

Para realizar a coloração por imunofluorescência, adicione anticorpos primários a uma amostra fixada em uma lamínula colocada em uma placa de Petri. Os anticorpos se ligam à proteína histona fosforilada gama-H2AX. Incube a amostra e lave-a com PBS para remover anticorpos não ligados. Em seguida, adicione anticorpos secundários que transportam fluoróforos, que reconhecem anticorpos primários e se ligam a eles. Adicione a quantidade desejada de coloração fluorescente DAPI para contra-manchar os núcleos.

Monte cuidadosamente a lamínula em uma lâmina de vidro com um meio de montagem e observe as células sob um microscópio fluorescente. Os focos gama-H2AX aparecem como pontos fluorescentes distintos nas células cancer