Detecção de ROS com coloração DCFH-DA: Medindo ROS totais em linhagens de células de câncer colorretal
JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 3:50 min • April 30th, 2023
- As espécies reativas de oxigênio são produzidas predominantemente a partir das mitocôndrias quando os elétrons vazam da cadeia de transporte de elétrons. Esses elétrons se combinam com o oxigênio molecular, dando origem a várias espécies reativas de oxigênio, ou ROS. Nas células cancerígenas, há superprodução de espécies reativas de oxigênio. Essas moléculas de ROS altamente reativas podem danificar oxidativamente membranas, proteínas e DNA dentro da célula.
Níveis aumentados de ROS danificam o DNA, levando à ativação de uma via de sinalização oncogênica que causa a progressão do câncer. Portanto, é vital detectar os níveis de espécies reativas de oxigênio produzidas pelas células cancerígenas.
Comece retirando células cancerígenas do câncer colorretal humano em um meio de cultura apropriado. Em seguida, semeie essas células em uma placa de vários poços e adicione a solução de DCFH-DA. Incube a placa pela duração desejada. DCFH-DA atravessa a membrana celular. Uma vez dentro da célula, o DCFH-DA se converte em DCFH na presença de uma enzima esterase celular. Além disso, a oxidação do DCFH por espécies reativas de oxigênio produz moléculas fluorescentes verdes.
Observe as células sob um microscópio fluorescente. A intensidade da fluorescência verde indica o nível de espécies reativas de oxigênio na célula. No protocolo a seguir, usamos o corante DCFH-DA para corar espécies reativas de oxigênio nas células de câncer colorretal.
- Para manchar as células, remova o meio que contém o medicamento e lave-as uma vez com DMEM. Adicione 500 microlitros de solução de trabalho DCFH-DA em cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, remova o DCFH-DA dos poços e lave-os duas vezes com DMEM e uma vez com PBS.
Em seguida, adicione 500 microlitros de PBS a cada poço. Use o canal de proteína fluorescente verde no microscópio de fluorescência para obter imagens representativas das células. Em seguida, remova o PBS e adicione 200 microlitros de tampão de ensaio de radioimunoprecipitação a cada poço.
Incube a placa no gelo por cinco minutos e colete os lisados celulares em tubos de 1,5 mililitro. Centrifugue os tubos a 21.130 x g por 10 minutos a 4 graus Celsius. Em seguida, transfira 100 microlitros do sobrenadante para uma placa preta de 96 poços. Use um leitor de microplacas em um comprimento de onda de excitação de 485 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 530 nanômetros para medir a fluorescência em cada poço.
Em seguida, meça a concentração de proteína com o ensaio de Bradford transferindo 1 microlitro do sobrenadante para uma placa transparente de 96 poços com 100 microlitros de solução de ensaio de proteína. Use as concentrações de proteína para normalizar as intensidades de fluorescência.
Visão Geral
Este estudo investiga a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células de câncer colorretal e seu papel na progressão do câncer. A metodologia envolve a coloração de células cancerígenas com DCFH-DA para medir os níveis de ROS utilizando microscopia de fluorescência.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Pesquisa sobre Câncer
- Estresse Oxidativo
Antecedentes
- As espécies reativas de oxigênio são produzidas principalmente pelas mitocôndrias.
- A superprodução de ERO está associada a danos no DNA e à progressão do câncer.
- A detecção dos níveis de ERO é fundamental para compreender o comportamento das células cancerosas.
- DCFH-DA é uma sonda fluorescente utilizada para medir ERO em células.
Objetivo do Estudo
- Quantificar os níveis de ESP em células humanas de câncer colorretal.
- Compreender as implicações dos ESP na progressão do câncer.
- Estabelecer um método confiável para detecção de ESP utilizando microscopia de fluorescência.
Métodos Utilizados
- Cultive células de câncer colorretal humano em meio apropriado.
- Marque as células com DCFH-DA e incube.
- Lave as células e observe ao microscópio de fluorescência.
- Meça a intensidade da fluorescência para quantificar os níveis de ERO.
Resultados Principais
- O aumento da fluorescência verde indica níveis mais altos de ESP.
- As medidas de fluorescência correlacionam-se com a concentração de proteína.
- O método detecta efetivamente ESP em células cancerígenas.
Conclusões
- Os níveis de ERO são significativamente elevados em células de câncer colorretal.
- A coloração com DCFH-DA é um método válido para avaliar o estresse oxidativo.
- Compreender a dinâmica das ERO pode orientar estratégias de tratamento do câncer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção quantitativa de espécies reativas de oxigênio (ROS) totais em linhagens celulares de câncer colorretal permite a redução de riscos mecanicistas e a validação de alvos na descoberta oncológica. O protocolo de coloração com DCFH-DA fornece uma medida padronizada e reprodutível de ROS, apoiando a confiança preditiva em programas de biologia do câncer em estágios iniciais. Essa capacidade orienta a triagem e priorização de portfólios ao associar o estresse oxidativo à sinalização oncogênica e à progressão da doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite investigar o estresse oxidativo como um fator mecanicista em modelos de células cancerígenas.
- Apoia a validação funcional de alvos que modulam a produção ou resposta ao ROS.
- Fornece leituras quantitativas para análise de vias orientadas por hipóteses.
- Facilita a redução de riscos biológicos ao associar níveis de ROS à sinalização oncogênica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece um ensaio quantitativo validado para detecção de ERO em linhagens celulares aderentes.
- Fornece resultados reprodutíveis baseados em fluorescência, adequados para triagem de compostos.
- Permite padronização e normalização do ensaio utilizando controles de concentração proteica.
- Permite avaliação confiável de moduladores candidatos ao estresse oxidativo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a quantificação de espécies reativas de oxigênio com modelos relevantes para doenças de câncer colorretal.
- Apoia estratégias translacionais de biomarcadores ao associar espécies reativas de oxigênio a fenótipos celulares.
- Garante continuidade da descoberta até a validação pré-clínica de vias de estresse oxidativo.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco para terapêuticas direcionadas ao estado redox.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio de detecção de ERO com DCFH-DA integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico, permitindo testes de hipóteses robustos e análise quantitativa de vias em modelos de células cancerígenas.
- Biologia da Descoberta: Apoia o teste da hipótese nula sobre o envolvimento de ESP na sinalização oncogênica.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e quantitativas de fluorescência para prontidão do ensaio.
- Análises: Permite a normalização das medidas de ESP em relação ao conteúdo proteico para comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a quantificação de ESP com fenótipos celulares relevantes para doenças no câncer colorretal.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável e escalonável para medição de estresse oxidativo em diferentes programas de oncologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e nos estudos mecanicistas.
- Valor Operacional: Fornece fluxos de trabalho padronizados, reprodutíveis e escaláveis para quantificação de ERO.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção e reduz riscos biológicos em estágios avançados nos portfólios de oncologia.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos terapêuticos moduladores do estado redox.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência e análise com leitor de placas.
- Necessita de acesso a culturas celulares validadas, reagentes de coloração e ensaios de quantificação proteica.
- Exige padronização entre equipes quanto às condições do ensaio e protocolos de normalização.
- Adaptável a diversos modelos de células aderentes mediante otimização apropriada.
- Depende da normalização precisa em relação ao conteúdo proteico para comparação quantitativa.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Fluxo Cytometric medição da produção de ROS em macrófagos em resposta a FcγR cross-linking
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Quantificação em tempo real de espécies de oxigênio reativo em neutrófilos infectados com meningite escherichia coli
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Determinação de Membrana Mitocondrial Espécies de Oxigênio Reativas Potencial e em neurônios de rato vivo Cortical
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Câncer Colorretal Profiling proteína de superfície celular Usando um Microarray de anticorpos e Multiplexação de fluorescência
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Produção e Detecção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) em Câncer
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Visualização dos Vascular Ca 2 + Sinalização Disparado por parácrina ROS Derivado
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Detectando, visualizar e quantificar a geração de espécies reativas de oxigênio em um modelo de sistema Amoeba
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Redox Cellular Profiling Usando Microscopia de Alto Conteúdo
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Detecção de Espécies totais de oxigênio reativo em células aderentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining
Vídeos relacionados
0 Visualizações
Última atualização: 29 agosto 2026