Name: Estabelecer culturas de fibroblastos adultos primária de roedores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Aprenda a isolar fibroblastos primários de pele e pulmão de roedores silvestres usando digestão com colagenase. Este protocolo padronizado produz cerca de 10 milhões de células por fragmento de tecido, facilitando estudos de biologia celular.

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Agradecemos ao Dr. Steven Austad para fornecer-nos com a primeira versão do presente protocolo. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH e da Ellison Medical Foundation para VG e AS

1. Antes de Começar <ol><li> Esterilizar a tesoura e uma pinça com etanol 70%. </li><li> Lugar agitador magnético pequeno dentro de um copo 30 mL, cobrir com duas camadas de papel alumínio, e autoclave. </li><li> Prepare a 28 unidades Wunsch / mL solução estoque de Liberase Blendzyme 3 em água estéril. Faça alíquotas 0,5 mL e congelar a -20 ° C. Descongelar uma alíquota de novo antes de cada utilização. A solução pode parecer turvo após o descongelamento. Vortex a solução até que fique claro. </li><li> Aqueça o meio de cultura celular. </li></ol> 2. Preparação de amostras de animais Cuidado: animais selvagens podem conter agentes patogênicos, como um vírus da raiva. Sempre estar ciente de abrir farelos. <ol><li> Eutanásia do animal e colocar a carcaça a 4 ° C. O melhor é usar a carcaça de imediato, no entanto, se isso não é prático, como se os animais são recolhidos no campo, as carcaças podem ser usados ​​dentro de 24 horas. Após 24 horas a queda de produção celular. </li><li> Dissecar o animal no centro cirúrgico ou na capa químicos (não na capa da cultura de tecidos). </li><li> Axilas área é um local conveniente para coletar amostras de pele como a pele das axilas é mais fino, contém menos gordura, ea pele é menos denso. Limpar o local da incisão com etanol 70%. Verifique se o pêlo é embebido com álcool. </li><li> Raspar os pêlos ao redor do local da incisão com um bisturi afiado. Raspar uma área maior do que o local da incisão desejada. Tentar minimizar cortes na pele. Pulverizar a área com álcool 70% e deixe secar. </li><li> Para coletar uma amostra de pele especial sobre o consumo de um fragmento de aproximadamente 1 cm 2. Beliscar a pele com uma pinça, e cortar com tesoura. Tente não cortar a camada de gordura com a pele, como gordura interfere com a digestão da colagenase. Para coletar as amostras de pulmão, lave a área do peito com etanol 70%, e abra a pele do peito com uma tesoura, fazendo uma incisão em forma de T e puxar as abas para além da pele. Lave a área do músculo abriu com etanol 70% e deixe secar. Cortar a caixa torácica com a pinça estéril e tesoura (use cortadores de osso para animais de maior porte). Uso de técnicas estéreis para evitar a contaminação dos órgãos internos. Não toque os órgãos internos com instrumentos que tocou a pele de animal. Cortar fragmentos de pulmão de aproximadamente 1 cm 2 usando uma pinça e tesouras estéreis. </li><li> Fragmentos de tecido lugar em tubos de 50 ml com PBS estéril, para evitar a secagem. </li><li> Lavar a parte externa do tubos de 50 ml com fragmentos de tecido com etanol, e levá-los para a capa de cultura de tecidos. </li><li> Devidamente dispor de carcaça animal. </li></ol> 3. Células extrair <ol><li> Transferir os fragmentos de tecido em um prato de 10 centímetros cultura de tecidos utilizando bisturi estéril. Não transferir PBS muito com a amostra. </li><li> Corte o tecido em pedaços ~ 1 mm com dois bisturis. Use duas lâminas usando uma tesoura ação a partir do centro e afastamento. Manter o tecido enrolado, não corte pedaço por pedaço. Quando o corte é suficiente a pele se assemelha putty, ele não vai separar em pedaços, mas vai esticar fina. O tecido pulmonar é mais fácil de cortar, e ele irá separar-se em pequenos pedaços. </li><li> Usando um bisturi, transferir o tecido cortado em copo mL estéril 30 com barra de agitação estéril. Lave a placa usada para cortar tecido com 10 mL de DMEM/F12 mídia com 0,14 unidades Wunsch / mL Liberase Blendzyme 3, e 1X antibiótico / antimicótico e adicionar a solução para o copo 30 mL com fragmentos de tecido. </li><li> Cobrir o copo com papel alumínio estéril e incubar a 37 ° C, mexendo lentamente, por 30 a 90 minutos. A duração da incubação depende do tipo de espécies e tecidos. Tome cuidado para não sobre-digerir o tecido. Melhores rendimentos são obtidos quando fragmentos de tecido ainda estão presentes no final da digestão. Pele demora mais tempo para digerir do que o pulmão. Pele de animais de grande porte leva mais tempo para digerir. Verifique a digestão depois de 30 min, e depois a cada 10 min. Quando a digestão da pele é concluída, a mídia torna-se turva e fragmentos de pele separados uns dos outros, e as bordas das peças tornam-se "fuzzy". Digestão pulmonar deve ser interrompido quando mudam de cor fragmentos de pulmão de vermelho para branco e começar a formar fibras pegajosas. </li><li> Solução de pipeta contendo o fragmento de tecido para cima e para baixo para quebrar os aglomerados. Transferir a solução para tubo de 50 mL estéril. Se os fragmentos de mover-se facilmente através do corte da pipeta 10 mL e digestão foi bem feito. Lavar o copo 3 vezes com 10 mL de morno DMEM/F12 media com 15% FBS, 1X antibiótico / antimicótico e adicione os meios de comunicação para o tubo de 50 mL com fragmentos de tecido. Fechar o tubo de 50 mL e misturar por inversão várias vezes. A FBS na mídia vai parar a digestão Liberase. </li><li> Giram em 524 g em uma centrífuga balançando cultura balde do tecido por 5 min. Remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 10 mL de morno DMEM/F12 media com 15% FBS, 1X antibiótico / antimicótico. Pipeta com a suspensãoforça máxima para quebrar os pedaços de tecido. </li><li> Adicionar outro, 30 mL de DMEM/F12 media com 15% FBS, 1X antibiótico / antimicótico mix, e centrifugar a 524 g em uma centrífuga balançando cultura balde do tecido por 5 min. Repita mais uma vez para remover os vestígios do Liberase. </li><li> Ressuspender o sedimento em 10 mL de DMEM/F12 mídia com FBS 15%, 1X antibiótico / antimicótico e transferir para um prato de 10 centímetros cultura de tecidos e coloque em uma cultura de tecidos incubadora a 37 ° C, 5% CO 2, 3% O 2 . </li><li> Verifique as placas todos os dias para fibroblastos e cor media. Se o isolamento foi bem-sucedida, fibroblastos rastejar para fora dos fragmentos de tecido e fixe a placa (Figura 1). Os fibroblastos começam a sair fragmentos de tecido dentro de 2-5 dias. </li><li> Se a mídia muda de cor para amarelo, indica contaminação em potencial ou a superlotação de celas. Examine as placas sob o microscópio em grandes ampliações. Se as bactérias, fungos ou vermes estão presentes descartar as placas (isso raramente é um problema com animais de laboratório, no entanto pode ocorrer quando as amostras são coletadas na natureza). Se não houver contaminação está presente, mas a mídia mudou de cor, isso é causado por um excesso de células ou fragmentos de tecido demais colocados no mesmo prato. Se mais de 60% da placa é coberta por fibroblastos anexa, alterar a mídia sobre a placa e transferir os fragmentos de tecido para um novo prato com a nova mídia. Se não fibroblastos muitos ligados à placa, alterar a mídia e dividir os pedaços de tecido para um 2-4 pratos. </li><li> Após 7 dias, se a mídia não tivesse sido alterado anteriormente, alterar a mídia e transferir os fragmentos de tecido para um novo prato com as novas mídias. </li><li> Incubar as células e fragmentos de tecido para um adicional de 7 dias. Por 14 dias todos os fibroblastos viáveis ​​tenham saído os fragmentos de tecido. </li><li> Após 14 dias desde o início do isolamento de células, descartar a velha mídia e fragmentos de tecido, a colheita das células e placa-los em um novo prato de 5x10 5 células / EMEM placa com FBS 15%, 1X Penicilina / Estreptomicina, não aminoácidos essenciais , sódio e piruvato. EMEM mídia vai apoiar o crescimento de fibroblastos tipos de células e outros só vai morrer ou parar de proliferar. </li><li> Depois que as células chegar confluência de 80-90%, congelar uma alíquota de células para utilização futura. </li><li> Continue cultivando as células, dividindo-os em 5x10 5 células / placa quando as células atingem confluência de 80-90%. </li></ol> 4. Resultados representante Fibroblastos normais são células grandes com saliências proeminentes (lamellipodia) (Figura 2). Fibroblastos crescer em uma monocamada. Uma cultura saudável e em crescimento contém células 1-10% na fase M, reconhecido como arredondado células elevados sobre a superfície da placa, mas não retirado da placa (Figura 3). Tipicamente, um prato de 10 cm semeados com 5x10 5 células se torna confluente em 3-4 dias. O tempo de duplicação varia muito entre as espécies, e pode ser maior para algumas das espécies de vida longa de roedores 1. Quando as células encher um prato eles prendem a proliferação na fase G1. Prato típico confluentes de fibroblastos contém uma camada de células hermeticamente embalados (Figura 4). Quando as células atingem confluência de 90% que eles estão prontos para dividir. Se desejado, as células podem ser mantidos em uma placa presa confluentes por longos períodos de tempo com mudanças regulares de mídia (uma ou duas vezes por semana). <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Isolamento de fibroblastos da pele do rato (A) e pulmão (B). A mídia foi mudado para remover as células solto e detritos antes de tirar as fotos no dia 7. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fibroblastos de pulmão de rato. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Um campo de fibroblastos de rato com células em estágios M, fotografadas com ampliação de 10x. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Uma placa confluentes de fibroblastos de rato, fotografadas com ampliação de 10x.

<ol><li>Seluanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+tumor+suppressor+mechanisms+evolve+in+rodent+species+that+differ+in+size+and+lifespan.+Aging+%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging .</a> Cell. 7, 813-823 (2008).</li>
<li>Parrinello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Fibroblastos normais primárias oferecem uma excelente alternativa para as linhas de células de câncer estabelecido na pesquisa biológica. Uma vantagem importante de fibroblastos é que eles não carregam mutações em oncogenes e supressores de tumor e manter postos de controle do ciclo celular intacto. Isso faz com que fibroblastos normais de um sistema preferido para os estudos de regulação do ciclo celular, reparo do DNA e apoptose. O protocolo aqui descrito fornece uma receita simples para o isolamento e manutenção de f...

<table><tbody><tr><td>Meio DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (SBF), qualificado</td><td>Invitrogen</td><td>01437-036</td><td>O soro qualificado foi pré-testado para fornecer bom suporte de crescimento para fibroblastos primários.</td></tr><tr><td>Antibiótico/antimicótico</td><td>Invitrogen</td><td>15420-096</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Liberase TM Research Grade&lt;/strong&gt;</td><td>Roche</td><td>&lt;strong&gt;05401127001&lt;/strong&gt;</td><td>Enzima substituta.</td></tr><tr><td colspan="4">Nota dos autores: desde que a Roche descontinuou o Liberase Blendzyme 3 (11814184001), eles recomendam o uso do Liberase TM Research Grade com termolisina média (n.º do cat. 05401119001 - 10 mg, n.º do cat. 05401127001 - 100 mg) como alternativa. Mudamos com sucesso para esta enzima sem problemas.</td></tr><tr><td>Meio EMEM</td><td>ATCC</td><td>30-203</td><td>O meio EMEM da ATCC já contém aminoácidos não essenciais e piruvato de sódio.</td></tr><tr><td>Bisturi descartável estéril #21 com penas</td><td>Múltiplos fornecedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de controle de três gases</td><td>Forma ou Heraeus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estabelecer culturas de fibroblastos adultos primária de roedores

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

A importância de usar pilhas, ao invés de linhas celulares de cancro, para estudos biológicos está se tornando amplamente reconhecida. Pilhas são preferidas em estudos de células a apoptose ciclo de controle, e reparo do DNA, como as células cancerosas carregam mutações em genes envolvidos nestes processos. Pilhas não podem ser cultivadas indefinidamente devido ao início da senescência replicativa ou aneuploidization. Assim, novas culturas devem ser estabelecidas regularmente. O procedimento para o isolamento de fibroblastos de roedores embrionárias está bem estabelecida, mas isolar culturas de fibroblastos adultos, muitas vezes representa um desafio. Fibroblastos de roedores adultos isolados a partir de modelos do rato da doença humana pode ser um controle preferidos quando comparando-os com fibroblastos de pacientes humanos. Além disso, os fibroblastos adultos são o único material disponível quando se trabalha com roedores silvestres onde as fêmeas grávidas não podem ser facilmente obtidos. Aqui nós fornecemos um protocolo para isolamento e cultura de fibroblastos da pele de roedores adultos e os pulmões. Nós usamos este procedimento com sucesso para isolar os fibroblastos de mais de vinte espécies de roedores a partir de ratos de laboratório e em ratos de roedores silvestres como o castor, porco-espinho, e esquilo.

Este artigo descreve um protocolo para isolamento e manutenção de culturas de fibroblastos primários da pele e do tecido pulmonar dos roedores silvestres.

Estabelecer culturas de fibroblastos adultos primária de roedores

A importância do uso de células primárias, em vez de linhagens celulares cancerígenas, para estudos biológicos está a tornar-se amplamente reconhecida. As células primárias são preferíveis...

O isolamento de fibroblastos viáveis a partir de tecidos cutâneos e pulmonares de animais começa com a dissecação de fragmentos de pele e pulmão de um cadáver animal. Utilizando técnica estéril, o tecido é cortado em pequenos fragmentos e digerido com colagenase. Os fragmentos de tecido digeridos são então incubados em meio de cultura enriquecido até que os fibroblastos migrem para fora do tecido.Por fim, os fragmentos de tecido são removidos e o meio rico é substituído por meio de crescimento para fibroblastos. Após a repicagem das células, alíquotas são congeladas para uso futuro. Em última análise, um fragmento de tecido cutâneo ou pulmonar com um centímetro quadrado de área produz 10 elevado à sétima passagem de fibroblastos.E a principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos que não envolvem a digestão enzimática do tecido é que ela fornece um grande número de células a partir de uma variedade de espécimes animais. Este método ajudará pesquisadores da área de biologia comparativa a isolar eficientemente células sanguíneas de uma ampla variedade de espécies de mamíferos. Uma demonstração visual deste método é essencial, pois as etapas de digestão e piqueamento do t

establishing-primary-adult-fibroblast-cultures-from-rodents

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste artigo, descrevemos uma forma típica para isolar e cultura miócitos adulto coração de rato. Colagenase e protease são usadas para digerir e isolar miócitos único. Miócitos cultivadas seguir este protocolo de responder às necessidades mais experiência.

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Forças mecânicas desempenham um papel chave no desenvolvimento de pulmão e lesão pulmonar. Aqui, nós descrevemos um método para isolar roedores fetais de pulmão de células do tipo II epiteliais e fibroblastos e expô-los a estimulação mecânica utilizando...

Um sistema experimental para estudar Mecanotransdução em células do pulmão fetal

Este vídeo descreve o método rápido para isolar e cultivar os melanócitos e fibroblastos simultaneamente da pele do filhote de camundongo pós-natal. Essas células podem ser mantidas e manipuladas in vitro para estudar a biologia celular da pele, cicatrização de feridas e melanoma.

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Apresentamos um método para isolar as células multipotentes ingênuos precursoras da pele derivada (SKP) de culturas de fibroblastos humanos primários. Mostra-se que estas SKPs derivados a partir de culturas de fibroblastos de células estaminais partilham propriedades semelhantes às derivadas directamente a partir de biópsias de pele humana. Estas células expressam o marcador da crista neural, nestina, para além dos marcadores, tais como OCT4 multipotentes e Nanog.

Naïve Adult Stem Cells isolamento de culturas primárias de fibroblastos humanos

Apresentamos um protocolo para gerar culturas primárias de células estromais esofágicas murinas e humanas com fenótipo de miofibroblastos. As células cultivadas têm morfologia fusiforme, expressam α-SMA e vimentina e carecem de marcadores de superfície celular epitelial, hematopoiética e endotelial. As células estromais caracterizadas podem ser usadas em estudos funcionais de interações epitelial-estromal.

Isolamento de Miofibroblastos de Mouse e esôfago humano

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

O comportamento dos fibroblastos está subjacente a um espectro de entidades clínicas, mas permanecem mal caracterizados, em grande parte devido à sua heterogeneidade inerente. A pesquisa tradicional de fibroblastos depende da manipulação in vitro, mascarando o comportamento dos fibroblastos in vivo. Descrevemos um protocolo baseado em FACS para o isolamento de fibroblastos de pele de camundongo que não requer cultura de células.

Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

Nós descrevemos um procedimento experimental simples e rápida para a geração de fibroblastos primários dos ouvidos e caudas de camundongos. O processo não requer a formação especial animal e pode ser utilizado para a geração de culturas de fibroblastos de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias.

Culturas de geração primária de fibroblastos de rato orelha e da cauda Tecidos

Aqui apresentamos nosso protocolo para produzir induzido eritroide progenitores (iEPs) de fibroblastos adulto de rato usando orientada por factor de transcrição direta linhagem reprogramação (DLR).

Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide

Este protocolo esboça um método rápido para gerar simultaneamente culturas do melanócito e do fibroblasto da pele de 0-4 ratos velhos do dia. Estas culturas primárias podem ser mantidas e manipuladas in vitro para estudar uma variedade de processos fisiologicamente relevantes, incluindo biologia celular da pele, pigmentação, cicatrização de feridas e melanoma.

Geração rápida de culturas de melanócitos e fibroblastos de Murina primária

Nós apresentamos um protocolo para isolar fibroblastos adultos preliminares em uma maneira fácil, rápida e de confiança, performable por novatos (por exemplo, estudantes). O procedimento combina a digestão enzimática do tecido e a agitação mecânica com ondas ultra-sônicas para obter fibroblastos primários. O protocolo pode facilmente ser adaptado às exigências experimentais específicas (por exemplo, tecido humano).

Isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto

Aprenda a isolar fibroblastos primários de pele e pulmão de roedores silvestres usando digestão com colagenase. Este protocolo padronizado produz cerca de 10 milhões de células por fragmento de tecido, facilitando estudos de biologia celular.

Estabelecer culturas de fibroblastos adultos primária de roedores

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