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- O enriquecimento ambiental, ou EE, refere-se às modificações nos parâmetros do alojamento para obter efeitos benéficos em várias doenças, como o câncer. Em um camundongo portador de tumor, o EE ativa o sistema imunológico e reduz a inflamação, o que melhora a microbiota intestinal e melhora a taxa de sobrevivência. Para estudar as mudanças na microbiota intestinal, adicione a quantidade desejada de tampão de lise fecal em um tubo contendo as fezes do camundongo.
Centrifugar a amostra e transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Adicione tampão de lise de cloreto de guanidínio que desnatura DNase e RNase. Em seguida, adicione etanol e transfira a amostra para uma coluna de centrifugação de sílica.
O etanol ajuda o DNA a se ligar à sílica. Centrifugue a amostra. Agora, transfira a coluna para um novo tubo de microcentrífuga e adicione um tampão de eluição à coluna para eluir o DNA.
Centrifugar a amostra e rejeitar a coluna. Transfira a amostra para um tubo de PCR e execute a PCR para amplificar o DNA. Carregue o DNA no gel de agarose e realize eletroforese para quantificar o tamanho do DNA microbiano. No protocolo a seguir, isolaremos o DNA das fezes para analisar o efeito do EE na microbiota do cólon no camundongo tumorigênico.
- Utilize um kit comercial para isolar o DNA microbiano das fezes seguindo um protocolo de detecção de patógenos nas fezes. Ao fazer isso, transfira as amostras do freezer de 80 graus Celsius negativos em gelo seco e pese-as. Em seguida, configure um PCR que amplifica o DNA microbiano conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, limpe os produtos de reação usando esferas magnéticas.
Para a limpeza, primeiro, centrifugue brevemente a placa de PCR do amplicon para puxar os produtos da reação. Em seguida, vortex as esferas magnéticas para dispersá-las uniformemente e transferir alíquotas de 20 microlitros para cada poço de reação. Misture bem as esferas com a solução, pipetando todo o volume lentamente 10 vezes. Em seguida, deixe as contas repousarem por 5 minutos.
Em seguida, coloque a placa de PCR em um suporte magnético e aguarde 2 minutos para que os sobrenadantes desapareçam após a coleta magnética de grânulos. Em seguida, remova e descarte os sobrenadantes. Em seguida, com a placa ainda no ímã, encha cada poço de grânulos com 200 microlitros de etanol fresco a 80% e aguarde 30 segundos. Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante.
Repita esta etapa de lavagem uma vez e deixe as contas secarem ao ar por 10 minutos. Agora, elua os produtos de reação das esferas removendo a placa do suporte magnético e adicionando 52,5 microlitros de Tris a cada poço. Misture completamente as esferas em solução pipetando todo o volume lentamente 10 vezes. Em seguida, colete as esferas no suporte magnético como antes e transfira 50 microlitros dos sobrenadantes para uma placa PCR limpa. Cubra a placa com um adesivo transparente e guarde-a a menos 20 graus Celsius por até uma semana.