Isolamento de DNA microbiano de fezes: estudando o efeito do enriquecimento ambiental na diversidade do microbioma em modelo de tumor murino

0 views • 3:46 min • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- O enriquecimento ambiental, ou EE, refere-se às modificações nos parâmetros do alojamento para obter efeitos benéficos em várias doenças, como o câncer. Em um camundongo portador de tumor, o EE ativa o sistema imunológico e reduz a inflamação, o que melhora a microbiota intestinal e melhora a taxa de sobrevivência. Para estudar as mudanças na microbiota intestinal, adicione a quantidade desejada de tampão de lise fecal em um tubo contendo as fezes do camundongo.

Centrifugar a amostra e transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Adicione tampão de lise de cloreto de guanidínio que desnatura DNase e RNase. Em seguida, adicione etanol e transfira a amostra para uma coluna de centrifugação de sílica.

O etanol ajuda o DNA a se ligar à sílica. Centrifugue a amostra. Agora, transfira a coluna para um novo tubo de microcentrífuga e adicione um tampão de eluição à coluna para eluir o DNA.

Centrifugar a amostra e rejeitar a coluna. Transfira a amostra para um tubo de PCR e execute a PCR para amplificar o DNA. Carregue o DNA no gel de agarose e realize eletroforese para quantificar o tamanho do DNA microbiano. No protocolo a seguir, isolaremos o DNA das fezes para analisar o efeito do EE na microbiota do cólon no camundongo tumorigênico.

- Utilize um kit comercial para isolar o DNA microbiano das fezes seguindo um protocolo de detecção de patógenos nas fezes. Ao fazer isso, transfira as amostras do freezer de 80 graus Celsius negativos em gelo seco e pese-as. Em seguida, configure um PCR que amplifica o DNA microbiano conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, limpe os produtos de reação usando esferas magnéticas.

Para a limpeza, primeiro, centrifugue brevemente a placa de PCR do amplicon para puxar os produtos da reação. Em seguida, vortex as esferas magnéticas para dispersá-las uniformemente e transferir alíquotas de 20 microlitros para cada poço de reação. Misture bem as esferas com a solução, pipetando todo o volume lentamente 10 vezes. Em seguida, deixe as contas repousarem por 5 minutos.

Em seguida, coloque a placa de PCR em um suporte magnético e aguarde 2 minutos para que os sobrenadantes desapareçam após a coleta magnética de grânulos. Em seguida, remova e descarte os sobrenadantes. Em seguida, com a placa ainda no ímã, encha cada poço de grânulos com 200 microlitros de etanol fresco a 80% e aguarde 30 segundos. Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante.

Repita esta etapa de lavagem uma vez e deixe as contas secarem ao ar por 10 minutos. Agora, elua os produtos de reação das esferas removendo a placa do suporte magnético e adicionando 52,5 microlitros de Tris a cada poço. Misture completamente as esferas em solução pipetando todo o volume lentamente 10 vezes. Em seguida, colete as esferas no suporte magnético como antes e transfira 50 microlitros dos sobrenadantes para uma placa PCR limpa. Cubra a placa com um adesivo transparente e guarde-a a menos 20 graus Celsius por até uma semana.

06:50

O uso do Puzzle Box como uma forma de avaliar a eficácia de Enriquecimento Ambiental

Related Videos

0 Views

09:30

Um protocolo para alojar ratos em um ambiente enriquecido

Related Videos

0 Views

07:02

Fornecendo o enriquecimento ambiental significativo e medindo o cortisol do saliva nos porcos alojados no revestimento slatted

Related Videos

0 Views

09:01

Avaliação não invasiva da eficácia de novos Therapeutics para Intestinal Patologias Usando imagem endoscópica série da Vivo Ratos

Related Videos

0 Views

08:14

Um método para definir os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade de Microbiome cólon em um modelo de Tumor de cólon de Mouse

Related Videos

0 Views

08:32

Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

Related Videos

0 Views

11:22

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

Related Videos

0 Views

05:28

Análise da dinâmica da microbiota fecal em camundongos propensos a lúpus usando um método de isolamento de DNA simples e econômico

Related Videos

0 Views

07:32

Isolamento Fecal Murino e Transplante de Microbiota

Related Videos

0 Views

07:45

Preparação e Manutenção do Experimento de Gaiola IsoPositivo de Bioexclusão para Transplante Fecal Humano em Camundongos Livres de Germes

Related Videos

0 Views

Last updated: 25 July 2026