Marcação de células organoides CRC: um método para gerar células organoides de câncer colorretal transduzidas por lentivírus GFP

- Organoides são construções celulares tridimensionais in vitro que se auto-organizam para imitar as principais características teciduais de seu órgão de origem. Para começar a rotular, trate os organoides colhidos com um coquetel de enzimas proteolíticas e colagenolíticas para dissociar as células em suspensão. Centrifugue para separar as células do sobrenadante contendo enzimas. Descarte o sobrenadante. Dissolver o sedimento celular utilizando um meio contendo vetores lentivirais. Esses vírus recombinantes carregam a sequência de codificação de uma proteína fluorescente verde ou GFP.

Os vírus se fundem com as células e liberam seu material genético e certas enzimas virais no citoplasma. A transcriptase reversa viral sintetiza o DNA viral complementar que se move para o núcleo do hospedeiro. A integrase viral ajuda a incorporar o DNA viral contendo a sequência GFP no genoma do hospedeiro. Cultive essas células transduzidas em uma matriz extracelular ou placa de cultura revestida com ECM. Aspire o meio e centrifugue para coletar quaisquer células soltas. Ressuspenda as células em ECM adicional.

Sobreponha a suspensão na cultura aderente para promover a viabilidade celular. Assim que a matriz solidificar, adicione meio de cultura e incube para facilitar a formação de organoides. Observar a cultura ao microscópio de fluorescência. As células transduzidas sintetizam proteínas fluorescentes verdes. Os organoides formados a partir dessas células exibem positividade para GFP. O protocolo a seguir demonstra a transdução de lentivírus GFP em células organoides de câncer colorretal derivadas do paciente.

- Após 7 a 10 dias de cultura, retire os organoides mecanicamente com um raspador de células estéreis e transfira os organoides para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro para sua centrifugação. Em seguida, ressuspenda os pellets em 500 microlitros de PBS com batidas suaves para outra centrifugação. Para dissociar os organoides do câncer colorretal, adicione 500 microlitros de solução enzimática proteolítica e colagenolítica aos tubos e misture com batidas suaves.

Após 10 minutos em temperatura ambiente, adicione 500 microlitros de meio suplementado com 1% de FBS às células e pipete suavemente a suspensão celular várias vezes para quebrar os organoides.

- A pipetagem suave de organoides CRC humanos durante a passagem é fundamental para manter uma formação esferóide intacta na cultura.

- Centrifugue as células novamente e ressuspenda os pellets em 100 microlitros de estoque de lentivírus GFP 5x e 400 microlitros de meio de cultura organoide de câncer colorretal fresco.

- É essencial infectar os organoides humanos do CRC com um alto título de lentivírus GFP, particularmente para atingir uma eficiência de infecção de quase 100%.

- Ajuste o volume em cada tubo para atingir 5 vezes 10 elevado à quinta célula tumoral dissociada por 500 microlitros de concentração média e coloque 500 microlitros de células em cada poço de uma placa de 12 poços revestida com matriz extracelular artificial, conforme demonstrado. Após 18 horas na incubadora de cultura de células, transfira os sobrenadantes contendo células flutuantes para tubos de microcentrífuga individuais de 1,5 mililitro para centrifugação, seguido de ressuspensão dos pellets em 70 microlitros de matriz extracelular artificial por tubo em gelo.

Para aumentar a viabilidade das células cancerígenas colorretais, sobreponha a matriz extracelular artificial contendo células tumorais nos organoides tumorais na placa de 12 poços e coloque a placa na incubadora de cultura de células por 30 minutos. Quando o revestimento da matriz extracelular artificial estiver solidificado, alimente as culturas com 1 mililitro de meio de cultura organoide CRC fresco suplementado com 1% de FCS e devolva as células à incubadora de cultura de células por três dias. Em seguida, observe as células infectadas por microscopia de fluorescência para confirmar uma positividade de quase 100% de GFP e retorne as células à incubadora por mais 4 a 6 dias.