Marcação de células organoides CRC: um método para gerar células organoides de câncer colorretal transduzidas por lentivírus GFP

- Organoides são construções celulares tridimensionais in vitro que se auto-organizam para imitar as principais características teciduais de seu órgão de origem. Para começar a rotular, trate os organoides colhidos com um coquetel de enzimas proteolíticas e colagenolíticas para dissociar as células em suspensão. Centrifugue para separar as células do sobrenadante contendo enzimas. Descarte o sobrenadante. Dissolver o sedimento celular utilizando um meio contendo vetores lentivirais. Esses vírus recombinantes carregam a sequência de codificação de uma proteína fluorescente verde ou GFP.

Os vírus se fundem com as células e liberam seu material genético e certas enzimas virais no citoplasma. A transcriptase reversa viral sintetiza o DNA viral complementar que se move para o núcleo do hospedeiro. A integrase viral ajuda a incorporar o DNA viral contendo a sequência GFP no genoma do hospedeiro. Cultive essas células transduzidas em uma matriz extracelular ou placa de cultura revestida com ECM. Aspire o meio e centrifugue para coletar quaisquer células soltas. Ressuspenda as células em ECM adicional.

Sobreponha a suspensão na cultura aderente para promover a viabilidade celular. Assim qu