JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 5:19 min • April 30th, 2023
- Comece tomando um camundongo mutante condicional anestesiado com um genoma modificado carregando sequências específicas de reconhecimento da enzima Cre-recombinase chamadas inserções LoxP que flanqueiam o gene supressor de tumor desejado a ser mutado. Exponha cirurgicamente a cavidade abdominal. Localize o cólon distal e prenda sua porção superior. Insira transanalmente um tubo de grau médico e avance-o para o cólon distal. Lave o cólon com solução salina para remover qualquer matéria fecal. Substitua o tubo. Prenda a região inferior do cólon para segmentação. Encha o segmento usando uma solução de dissociação celular adequada. Isso perfura a barreira mucosa e aumenta a acessibilidade das células da cripta intestinal. Lave a solução de dissociação.
Em seguida, injete uma suspensão adenoviral no segmento do cólon. Esses vetores virais projetados codificam enzimas Cre-recombinase. O vírus entra na célula, libera seu DNA no núcleo e expressa as enzimas. As proteínas reconhecem as inserções de LoxP no genoma do hospedeiro e catalisam a recombinação específica do local, inativando assim o gene supressor de tumor. Essa mutação de perda de função promove a progressão do câncer. Suture a incisão e permita que o camundongo se recupere. Monitore para observar o crescimento de tumores colorretais isolados. O protocolo a seguir mostra a geração de um modelo de camundongo com câncer colorretal por infecção segmentar por adeno-cre.
- Comece colocando um camundongo anestesiado em decúbito dorsal e aplique pomada nos olhos do animal. Prenda o mouse em uma posição segura e confirme o nível apropriado de sedação com o dedo do pé. Faça uma incisão na linha média de aproximadamente 15 milímetros na pele do abdômen inferior. Em seguida, use uma pinça para agarrar a musculatura da parede abdominal e incise cuidadosamente o músculo com uma tesoura para abrir a cavidade abdominal. Depois de identificar o cólon distal, aperte cuidadosamente o tecido com uma pinça delicada de aproximadamente 15 milímetros proximal ao ânus.
Em seguida, insira um tubo flexível de Teflon transanalmente, avançando cuidadosamente o tubo até atingir a oclusão luminal e canule o tubo com uma cânula de calibre 30. Conecte uma seringa padrão de 1 mililitro à cânula e lave o cólon com vários mililitros de solução salina normal até que toda a matéria fecal tenha sido evacuada. Quando o cólon distal estiver vazio, substitua o tubo salino por um novo tubo de Teflon e use uma segunda pinça para ocluir o cólon aproximadamente 3 milímetros distal à primeira pinça.
Usando uma segunda seringa de 1 mililitro equipada com uma cânula de calibre 30, injete cuidadosamente 50 a 80 microlitros de tripsina-EDTA a 0,25% no segmento do cólon clampeado. O cólon deve inflar o suficiente para romper a barreira mucosa sem perfurar o segmento de tecido pinçado. Após 10 minutos, remova o clamp distal. Em seguida, remova o tubo de tripsina e lave o cólon distal com 500 microlitros de solução salina normal.
Depois de inserir um novo tubo de Teflon, aperte o cólon novamente e infle o tecido com 50 a 80 microlitros da solução adenoviral. Após 30 minutos, remova as pinças e o tubo e feche a parede abdominal com suturas contínuas 6-0 rapidamente absorvíveis. Feche a pele com clipes de ferida cirúrgica e monitore o animal em uma almofada de aquecimento até que esteja totalmente recuperado.
Para monitorar o crescimento do tumor por meio de colonoscopia, coloque o animal portador do tumor anestesiado em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento e insira o endoscópio transanalmente no trato intestinal. Insufle suavemente o ar sob controle visual para distender o cólon. Em seguida, empurre cuidadosamente o endoscópio para frente até que a lesão mucosa possa ser identificada no cólon distal, guardando cada imagem endoscópica à medida que é adquirida para avaliação posterior. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, remova lentamente o endoscópio e coloque o mouse em uma almofada de aquecimento a 38 graus Celsius até que esteja totalmente recuperado.