Ensaio de fosfatase em células CRC: um método para examinar o estado de fosforilação da proteína Tau em células de câncer colorretal

- A proteína Tau localiza-se perifericamente no nucléolo nas células cancerígenas colorretais e ajuda a manter a estrutura nucleolar. Principalmente, essas células expressam proteína tau hiperfosforilada, o que resulta em resistência a medicamentos. Assim, analisamos os níveis de fosforilação da tau realizando um ensaio de fosfatase.

Comece tomando o lisado celular contendo proteína total de células de câncer colorretal humano em dois frascos rotulados como teste e controle. Trate a amostra de teste com enzima fosfatase alcalina. A fosfatase alcalina remove os grupos fosfato da tau, enquanto o frasco de controle retém a proteína tau fosforilada.

Em seguida, execute a amostra e a tau de controle em um gel de poliacrilamida para separar as proteínas. A tau fosforilada se move mais lentamente no gel do que a proteína tau não fosforilada. Eletroblot a amostra de proteína para uma membrana adequada e adicione anticorpos primários correspondentes a tau fosforilada e normal.

Incube a mancha durante a noite. Trate o blot com anticorpo secundário conjugado com enzima repórter que se liga à região Fc do anticorpo primário. Finalmente, desenvolva o blot usando substrato quimioluminescente par