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- A proteína Tau localiza-se perifericamente no nucléolo nas células cancerígenas colorretais e ajuda a manter a estrutura nucleolar. Principalmente, essas células expressam proteína tau hiperfosforilada, o que resulta em resistência a medicamentos. Assim, analisamos os níveis de fosforilação da tau realizando um ensaio de fosfatase.
Comece tomando o lisado celular contendo proteína total de células de câncer colorretal humano em dois frascos rotulados como teste e controle. Trate a amostra de teste com enzima fosfatase alcalina. A fosfatase alcalina remove os grupos fosfato da tau, enquanto o frasco de controle retém a proteína tau fosforilada.
Em seguida, execute a amostra e a tau de controle em um gel de poliacrilamida para separar as proteínas. A tau fosforilada se move mais lentamente no gel do que a proteína tau não fosforilada. Eletroblot a amostra de proteína para uma membrana adequada e adicione anticorpos primários correspondentes a tau fosforilada e normal.
Incube a mancha durante a noite. Trate o blot com anticorpo secundário conjugado com enzima repórter que se liga à região Fc do anticorpo primário. Finalmente, desenvolva o blot usando substrato quimioluminescente para identificar a proteína tau da amostra de proteína total presente no blot. No protocolo a seguir, demonstraremos o ensaio de fosfatase para avaliar o estado geral de fosforilação da tau em células CRC.
- Depois de preparar amostras contendo 20 microgramas de proteína total, adicione dois microlitros de tampão fosfatase alcalina e 10 microlitros de fosfatase alcalina a cada um. Em seguida, adicione água destilada de forma que o volume final de cada amostra seja de 20 microlitros.
Incube as amostras a 37 graus Celsius por uma hora. Enquanto as amostras incubam, prepare amostras adicionais na mesma concentração, mas sem fosfatase para comparação. Após uma hora, parar a reacção adicionando EDTA a uma concentração final de 50 milimolares ou ortovanadato de sódio a uma concentração final de 10 milimolares.
Adicione um tampão de carregamento de gel SDS 4X recém-preparado contendo 400 DTT milimolar. Usando um bloco de calor, incube as amostras a 100 graus Celsius por cinco minutos. Vortex as amostras e deixe-as esfriar em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos.
Em seguida, carregue 13 microlitros de amostra por poço, bem como a escada de peso molecular em um gel de poliacrilamida a 10%. Conecte o sistema de eletroforese a uma fonte de alimentação e ajuste a tensão para 70 volts por 20 minutos para mover as amostras de proteína do gel de empilhamento para o gel de resolução.
Depois disso, aumente para 125 volts e deixe o gel funcionar por aproximadamente 70 a 120 minutos, até que as amostras e a escada de proteínas cheguem ao final do gel. Usando um sistema de eletroblotting úmido, transfira o gel para uma membrana de fluoreto de polivinilideno a 100 volts por cerca de 100 minutos.
Em seguida, incube a membrana para enxugar em albumina de soro bovino a 4% por 90 minutos em temperatura ambiente. Incube o blot durante a noite em solução de anticorpo primário a 4 graus Celsius. No dia seguinte, lave o borrão três vezes em PBST, lavando por sete minutos de cada vez.
Incubar na solução de anticorpos secundários relevante durante 90 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave com PBST quatro vezes, com cada lavagem durando sete minutos. Desenvolva o blot usando um kit de quimioluminescência de acordo com as instruções do fabricante.
Cubra a mancha revelada com filme plástico transparente e, em seguida, adquira imagens de quimioluminescência da mancha com um sistema de imagem de quimioluminescência disponível comercialmente.