Ensaio de ligação de microtúbulos em células CRC: um método para examinar a proteína Tau de ligação de microtúbulos em células de câncer colorretal

- Tau é uma proteína associada a microtúbulos envolvida na estabilização e montagem dos microtúbulos. Muitas células cancerígenas expressam proteína tau hiperfosforilada, que não consegue manter uma ligação de microtúbulos bem organizada. Para estudar a interação entre a proteína tau e os microtúbulos, adicione lisado de células cancerígenas contendo proteína tau e uma solução de trabalho de microtúbulos em um tubo de microfúgio.

As proteínas tau não fosforiladas presentes no lisado celular se ligam aos microtúbulos. Agora, adicione a quantidade desejada de tampão PEM no tubo para estabilizar a atividade da tubulina, uma proteína que polimeriza em filamentos para formar microtúbulos. Incube a mistura pela duração desejada.

Centrifugue a mistura para pellet a proteína ligada aos microtúbulos. A proteína não ligada permanece no sobrenadante. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e voltar a suspender o sedimento num tampão adequado. Adicione um tampão de carregamento de gel à suspensão de pellets ressuspensa e execute as amostras em um gel de poliacrilamida para separar a proteína ligada aos microtúbulos e eletroblot em uma membrana adequada.

Adicione anticorpos adequados e desenvolva o blot usando substrato de quimioluminescência para identificar as proteínas tau ligadas. No protocolo a seguir, realizaremos o ensaio de ligação de microtúbulos para identificar proteínas ligadas a microtúbulos.

- Depois de preparar amostras frescas, incube-as a 37 graus Celsius por 30 minutos. Ultracentrifugue as amostras a 100.000 x g e 25 graus Celsius por 60 minutos. Em seguida, transfira 120 microlitros de cada sobrenadante contendo tau não ligado para separar os tubos limpos e rotulados. Adicione 120 microlitros de tampão de amostra 5X ao pellet que contém tau ligado.

Depois de misturar bem por vórtice e pipetagem, transfira a mistura para tubos limpos e rotulados. Depois de preparar amostras de concentração de proteína equivalente, adicione um novo tampão de carregamento de gel 4X SDS contendo 400 DTT milimolar. Use um bloco de calor para incubar as amostras a 100 graus Celsius por cinco minutos.

Vortex as amostras e deixe-as esfriar em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Carregue 13 microlitros de amostra por poço e a escada de peso molecular em um gel de poliacrilamida a 10%. Conecte os eletrodos positivo e negativo do sistema de eletroforese a uma fonte de alimentação e, em seguida, ajuste a tensão para 70 volts por 20 minutos.

Depois disso, aumente para 125 volts e deixe o gel funcionar por aproximadamente 70 a 120 minutos até que as amostras e a escada de proteínas cheguem ao final do gel. Use o sistema de eletroblotting úmido para transferir o gel para uma membrana de fluoreto de polivinilideno a 100 volts por cerca de 100 minutos. Incube a membrana para enxugar em albumina de soro bovino a 4% por 90 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, incube durante a noite em solução de anticorpo primário a 4 graus Celsius.

No dia seguinte, lave o borrão quatro vezes com PBST, com cada lavagem durando sete minutos. Incubar a mancha lavada numa solução de anticorpos secundários pertinente durante 90 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave com PBST por sete minutos, repetindo a lavagem um total de quatro vezes. Desenvolva o blot usando um kit de quimioluminescência. Cubra com filme plástico transparente e adquira imagens usando um sistema de imagem por quimioluminescência.