Isolamento CTC de uma amostra de sangue total: um método para obter CTCs de modelo de câncer colorretal murino

- Células tumorais circulantes, ou CTCs, são as células cancerígenas que se originam do tumor primário e entram na circulação sanguínea. A maioria das CTCs pode sobreviver na corrente sanguínea sem se fixar na superfície; portanto, podemos detectá-los diretamente do sangue da maioria dos pacientes com câncer.

As CTCs no sangue podem indicar a disseminação do tumor dentro do corpo, portanto, identificá-las ajuda a entender a progressão do câncer. Comece tomando um modelo de camundongo com câncer colorretal anestesiado e obtenha sangue por punção cardíaca. Transfira o sangue para um tubo cônico contendo meio de gradiente de densidade e centrifugue para separar os componentes do sangue.

Rejeitar a camada superior que contém plasma e recolher a fracção de células mononucleares do sangue periférico, ou PBMC, presente na interface num tubo separado. Em seguida, adicione o anticorpo anti-EpCAM às células PBMC e observe sob um microscópio fluorescente. As CTCs circulantes expressam um marcador celular conhecido como Molécula de Adesão Celular Epitelial ou EpCAM. Portanto, os anticorpos anti-EpCAM podem ajudar a identificar CTCs positivas para EpCAM.

Colete as CTCs e armazene-as para análise posterior a jusante. No protocolo a seguir, identificaremos as CTCs que expressam EpCAM da fração de células mononucleares periféricas do sangue do modelo de camundongo com câncer colorretal.

- Para isolar as células tumorais circulantes no ponto final experimental apropriado, encha tubos cônicos de 15 mililitros com 5 mililitros de meio de gradiente de densidade por tubo e transfira cuidadosamente amostras de sangue total coletadas de animais portadores de tumor para as camadas de gradiente de densidade.

Separe as células por centrifugação e recupere cuidadosamente a interface que contém as células mononucleares. Pipetar as células mononucleares para um novo tubo de 15 mililitros para uma segunda centrifugação, seguida de duas lavagens em PBS. Após a segunda lavagem, ressuspenda os pellets em 200 microlitros de PBS suplementado com EDTA e adicione quatro microlitros de anticorpo anti-EpCAM a cada amostra para uma incubação de 20 minutos no gelo no escuro.

Em seguida, use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar um círculo de aproximadamente 1 centímetro em uma placa de Petri estéril de 6 centímetros por amostra e adicione 700 microlitros de tampão de coleta a cada círculo, seguido por 50 microlitros de suspensão celular. Use um microscópio para verificar a densidade das células e permitir que as amostras se assentem por cerca de cinco minutos. Em seguida, rastreie a gota de células para positividade de EpCAM e use o micromanipulador para transferir as células de interesse para 50 microlitros do tampão apropriado para a análise subsequente pretendida.