Microdissecção a laser: uma técnica para isolar células invasoras de câncer colorretal a partir de um modelo de cultura organotípica 3D

0 vistas3:53 min • April 30th, 2023

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- Modelos organotípicos 3D de câncer colorretal são culturas in vitro projetadas para imitar microambientes tumorais in vivo. A cultura geralmente contém células estromais, como fibroblastos, co-cultivadas com células epiteliais do câncer colorretal, em um microambiente de matriz extracelular adequado.

Em culturas estabelecidas, células tumorais com potencial metastático invadem a matriz extracelular. Para isolar essas células invasoras, primeiro trate o modelo organotípico com formaldeído para fixar as células e a matriz extracelular. Incube com álcool para desidratar a amostra.

Em seguida, incorpore em cera de parafina líquida para gerar um bloco de tecido. Use um ultramicrótomo para obter seções em fatias finas. Monte as seções em uma lâmina de vidro apropriada.

Adicione xileno para desparafinizar as seções. Sequencialmente, incubar as seções em concentrações decrescentes de etanol para reidratar as amostras.

Trate com Cresyl Violet para corar e diferenciar as células cancerígenas colorretais do microambiente. Coloque a lâmina de vitral voltada para baixo na platina do microscópio. Usando o software apropriado, identifique as células a serem microdissecadas e delineie as bordas. Dispare o laser para cortar a seção destacada e coletar a parte microdissecada.

No protocolo a seguir, mostraremos o isolamento de células de câncer colorretal a partir de um modelo de co-cultura organotípica 3D por microdissecção a laser.

- Remova todo o organotípico, incluindo a folha de náilon, do poço e coloque-o sobre filme plástico. Dividir a folha organotípica e de nylon com um bisturi descartável limpo e fixar ambas as metades em formaldeído durante 24 horas à temperatura ambiente. Substitua o formaldeído por etanol a 70% após 24 horas e deixe durante a noite antes de incorporar em parafina, seccionamento e coloração.

Para realizar a microdissecção a laser, primeiro corte o organotípico com espessura de 10 mícrons em lâminas montadas em membrana. Depois de tratar os cortes conforme descrito no protocolo de texto, prepare-se para realizar a microdissecção a laser usando a plataforma escolhida.

Coloque a lâmina de vidro com a seção manchada a ser microdissecada voltada para baixo no microscópio stage. Monte um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro no de coleta e adicione 50 microlitros de tampão de lise celular à tampa na qual o tecido microdissecado será coletado. Sob visão direta, use o joystick para identificar o tecido de interesse e, usando a interface do software, anote o corte orgânico corado, destacando as células a serem microdissecadas na frente de invasão do tumor.

Instrua o laser a disparar, o que deve cortar a seção destacada e impulsionar o tecido microdissecado para dentro da tampa do tubo da microcentrífuga. Proceder ao tratamento das amostras por um método adequado para extrair a substância a analisar em causa.

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Última atualização: 22 agosto 2026