Ensaio de Organização de Citoesqueleto e Adesão Focal: Um Método Baseado em Imunofluorescência para Estudar a Adesão e Espalhamento Celular em Substratos

- A morfologia do substrato influencia muito o comportamento e as respostas metastáticas das células cancerígenas. Uma rede dinâmica de citoesqueleto de actina fornece suporte estrutural às células e medeia o movimento celular. Grandes complexos de proteínas associados à membrana, chamados aderências focais, conectam o citoesqueleto à matriz extracelular, facilitando a disseminação celular.

Para começar a colorir, pegue uma cultura de células cancerígenas e trate-as com paraformaldeído para fixar e permeabilizar as células. Agora, incube as células com um reagente intensificador de sinal contendo proteínas para preparar as células para reduzir a coloração de fundo. Adicione anticorpos primários anti-vinculina que se ligam à vinculina, uma das proteínas dentro do complexo de adesão focal.

Em seguida, incube a amostra com um anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente direcionado ao anticorpo primário. Finalmente, trate as células com conjugados de faloidina marcados com fluorescência que se ligam seletivamente aos filamentos de actina do citoesqueleto. Observe as células sob um microscópio confocal de varredura a laser para estudar seus sinais fluorescentes.

Células com morfologia bem espalhada exibem fibras de actina definidas e apresentam aderências focais distintas e alongadas contendo vinculina. Por outro lado, células mal espalhadas não possuem filamentos de actina definidos, mas exibem aderências focais pontilhadas contendo vinculina. No protocolo a seguir, demonstraremos um ensaio de imunofluorescência para estudar o citoesqueleto e a organização da adesão focal em células de câncer de cólon primário.

- Leve os substratos a serem imunomarcados para a capa laminar e remova os meios de cultura. Em seguida, enxágue os substratos com solução salina tamponada com fosfato, ou PBS, e fixe as células com paraformaldeído a 4% em PBS por 20 minutos em temperatura ambiente. Lave os substratos com PBS por cinco minutos no total de três vezes. Em seguida, incube os substratos com 500 microlitros de intensificador de sinal por 30 minutos antes de enxaguar com PBS.

Em seguida, incube as células com anticorpo monoclonal anti-vinculina em uma diluição de 1 a 250 em PBS por 45 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave os substratos com PBS por cinco minutos, um total de três vezes. Incube as amostras com um anticorpo secundário Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG em uma diluição de 1 a 200 em PBS em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, lave os substratos novamente com PBS por cinco minutos, um total de três vezes.

Para visualizar a estrutura da F-actina, incube as células com conjugados tetrametilrodamina-faloidina a uma concentração de 50 microlitros por mililitro por 45 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave os substratos novamente como antes. Finalmente, prossiga para a imagem das amostras usando um microscópio a laser de varredura confocal.

• Focal Adhesion - Protein complex facilitating cell-cytoskeleton and extracellular matrix connection.
• Vinculin - An integral protein within the focal adhesion complex.
• Actin Cytoskeleton - Provides structural support to cells and mediates cellular movement.
• Immunofluorescence - A staining method used to visualize components within a cell.
• Cell Spreading - The process related to cell movement and attachment involving focal adhesions and actin filaments.

• Introduce Focal Adhesion - Protein complex connecting actin cytoskeleton and extracellular matrix (e.g., vinculin).
• Key Concepts - Supporting cell's structural integrity, movement, and interactions (e.g., actin network).
• Underlying Mechanisms - Fundamental processes facilitating cell adhesion, spreading, and movement.
• Connect to Experiment - Using immunofluorescence to visualize actin and vinculin in cancer cells.

• What is focal adhesion and how does it facilitate cellular movement and interaction?
• How does vinculin function within the focal adhesion complex?
• How is immunofluorescence used to study the organization of actin cytoskeleton and focal adhesion?

• Practical Applications – Understanding cellular behavior and responses through immunofluorescence (e.g., cancer research).
• Industry Impact – Enhancing the understanding of cell morphology in biomedical sector (e.g., drug development).
• Societal Importance – Broadening comprehension of diseases trajectory and treatment options (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements - Immunofluorescence marks a significant advancement in cell biology studies.