JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 4:23 min • April 30th, 2023
- As células-tronco dos melanócitos quiescentes, em resposta à radiação UV ou depilação do cabelo, são ativadas. As células-tronco do melanoma ativado podem levar ao melanoma cutâneo - uma forma de câncer de pele. Para estudar o melanoma, preparamos blocos de tecido cutâneo congelado para reter as estruturas nativas de DNA e proteínas durante o procedimento de fixação.
Comece colocando um camundongo melanoma sacrificado em uma cama cirúrgica e remova os pelos da região dorsal da pele acima da cauda. Extirpar a pele e cobri-la com um papel de filtro. Em seguida, mergulhe o papel de filtro contendo tecido cutâneo em formalina tamponada neutra pelo tempo desejado. A formalina penetra no tecido da pele e se liga aos aminoácidos, o que causa a reticulação de proteínas, levando à fixação do tecido.
Retire o tecido da pele do papel e corte o tecido para obter pedaços do tamanho desejado. Agora, incorpore os pedaços de tecido verticalmente em um criomoldor preenchido com meio OCT e coloque os criomoldes em gelo seco. OCT é uma matriz de amostra que se solidifica no congelamento e forma uma camada gelatinosa ao redor da amostra de tecido que a mantém no lugar. Use os blocos congelados para outros ensaios histológicos. No protocolo a seguir, prepararemos blocos de tecido cutâneo congelado da pele dorsal murina para estudar o melanoma cutâneo.
- Para isolar as amostras de pele, use um aparador elétrico para remover qualquer cabelo da área dorsal da pele dos camundongos irradiados sacrificados e escove levemente a pele exposta com um tecido sem fiapos para limpar a área. Faça uma pequena incisão com uma tesoura afiada logo acima da base da cauda e insira uma tesoura grande e romba na incisão para separar os tecidos conjuntivos subdérmicos. Usando uma tesoura afiada, corte cuidadosamente ao longo da borda da região da pele de interesse para isolar a amostra de tecido e coloque o tecido de pele excisado em uma toalha de papel limpa.
Em seguida, use uma pinça cega para esticar a pele para que ela adira à toalha e fique esticada. Quando todas as amostras tiverem sido colhidas, coloque a amostra de pele e o suporte de papel toalha em um pedaço de papel de filtro dobrado imediatamente adjacente ao vinco, tomando cuidado para que a amostra fique lisa e não dobrada ou amassada. Feche as laterais do papel de filtro com grampos e corte o papel. Em seguida, mergulhe totalmente as amostras em formalina tamponada a 10% neutra por 3 a 5 horas em temperatura ambiente antes de lavar os tecidos com duas lavagens de 5 minutos em água deionizada.
Após a segunda lavagem, remova cuidadosamente qualquer material residual dos tecidos da pele e apare as bordas da amostra para que não fiquem irregulares. Em seguida, faça três cortes sagitais em cada amostra para que a largura das tiras não seja superior a 5 milímetros e faça cortes transversais para que as amostras não tenham mais de 20 milímetros de largura. Posicione um criomold contendo a temperatura de corte ideal ou o meio OCT na orientação retrato e coloque quatro a cinco pedaços de pele por cima do OCT.
Quando todas as peças estiverem no lugar, use dois pares de pinças finas para trazer a borda longa de cada pedaço de pele para o fundo do criomold, de modo que as amostras fiquem verticais dentro da OCT e perpendiculares à base do molde. Em seguida, preencha o molde com OCT adicional no segundo lábio e coloque o molde em uma superfície plana de um pedaço de gelo seco, usando uma pinça para ajustar quaisquer pedaços de pele que possam ter se deslocado durante a transferência quando o bloco começar a congelar conforme necessário.