Name: Cultura do mouse pulmão embrionário, um sistema para avaliar os mecanismos moleculares de Ramificação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar pulmões embrionários de camundongo para estudar interações epiteliais-mesenquimais e ramificação pulmonar. Este método permite observar alterações morfológicas em resposta a tratamentos específicos.

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Pesquisa Saban Prêmio Pré-doutorado (PMDM), e pelo NIH RO1 HL75773 (DW).

Cultura de órgãos é uma técnica muito útil e versátil para o estudo do gene e expressão da proteína. Estes métodos de cultura ex vivo pode ser usado como preliminar ou em complemento a estudos in vivo. 1. Isolamento Lung embrionárias <ol><li> Cronometrado grávidas ratos são sacrificados no dia postcoitum 11,5 ou 12,5 (E11.5-12.5) pelo CO 2 narcose acordo com as diretrizes do NIH e OLAW. O animal é colocado em uma câmara de CO 2 e 100% é introduzido. Depois que o animal está inconsciente o fluxo de CO 2 é maior. Morte clínica do animal deve ser assegurada. </li><li> Todos os passos seguintes devem ser concluídas em condições estéreis em capela de fluxo laminar. O útero é removido as fêmeas grávidas. Para remover o útero do animal, as fêmeas grávidas são colocados em suas costas e pulverizadas com etanol 70%. É feita uma incisão no abdômen, ea pele é removida por puxar a pele para cima, mantendo as patas traseiras do animal. A cavidade peritoneal é aberta eo útero é retirado do animal. </li><li> O sangue é retirado com água, colocando o útero em um tubo de 50 ml cheio de frio Solução Salina Balanceada Hanks (HBSS), eo tubo é suavemente embalado por 2 minutos. </li><li> O útero é então colocado em uma placa de Petri sob o microscópio estereoscópico de dissecação, e os embriões liberados do útero por uma incisão na parede uterina usando uma tesoura primavera. Os embriões são colhidos usando uma colher perfurada, e colocado no gelo em uma placa de Petri contendo novas HBSS. </li><li> Sob o microscópio estereoscópico de dissecação, pulmões embrionárias são dissecados, um por um numa placa de Petri contendo HBSS frio (Figura 1). </li><li> O pulmão isolado embrionárias é colocado sobre o gelo em uma placa de Petri contendo HBSS usando uma pipeta de transferência estéril. </li></ol> 2. Cultura Lung embrionárias <ol><li> 500 microlitros de 1 mililitro por poço de D-MEM/F-12 suplementado com 50 unidades / ml de penicilina-estreptomicina é adicionado em um prato de poliestireno Nunclon. </li><li> A membrana de policarbonato Nuclepore Track-Etch é colocado em cima da mídia. Quando a membrana de policarbonato Nuclepore Track-Etch é colocado em cima da mídia, certifique-se que o lado brilhante é contra a mídia, e é lado áspero para cima. </li><li> Um pulmão dissecados embrionário é colocado em cima da membrana de policarbonato Nuclepore Track-Etch usando uma pipeta de transferência estéril. </li><li> A posição de pulmão embrionário é ajustado com o fórceps. Pulmão embrionário colocada no filtro deve ter uma traquéia intacta e ser colocado com a traquéia ter uma posição reta, permitindo assim que todos os pulmões para ter a mesma pressão interna. </li><li> O prato de poliestireno Nunclon é transferido para a cultura desejada tempo em uma incubadora de células (Figura 2). </li></ol> 3. Materiais 1. Isolamento de pulmão embrionário Whole <ol><li> Timed-grávidas (C57BL6 tipo selvagem ou transgênicos) ratos para ser sacrificado no dia postcoitum 11,5-13,5 (E11.5-13.5). </li><li> Solução de Hanks salina balanceada (HBSS) (1X), líquido, sem cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, ou sulfato de magnésio. (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado com 50 unidades / ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Armazenar o HBSS à temperatura ambiente ea 4 ° C após a abertura. Alíquotas e armazenar a penicilina-estreptomicina a -20 ° C. </li><li> Estereomicroscópio estereoscópico (Leica, Wetzlar, Alemanha). </li><li> Ferramentas de dissecção incluindo Dumont pinças, tesouras Belas íris (reta), mola Noyes tesoura e uma colher Moria ® (perfurada) (Ferramentas Ciência Fine, Foster City, CA). </li></ol> 2. Cultura Lung embrionárias Whole <ol><li> Modificado Dulbecco Eagle Medium: Mix de nutrientes F-12 (D-MEM/F-12) (1X), líquido, 01:01 Contém L-glutamina, mas nenhum tampão HEPES. (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado com 50 unidades / ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Manter o frasco DMEM/F-12 longe da luz (por exemplo, cobertas por folhas de alumínio) e armazenar a 4 ° C. Alíquotas e armazenar a penicilina-estreptomicina a -20 ° C. </li><li> Nuclepore Policarbonato Membrana Track-Etch, 8,0 m, 13 mm (Whatman Nuclepore membrana Track-Etch (Whatman, Florham Park, NJ). </li><li> Nunclon prato com tampas de poliestireno, 4 poços (Rochester, NY). </li><li> Pipetas de transferência descartável, estéril (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Dissecção da E12 pulmões embrionárias. (A) E12.5 embrião todo visto do lado direito. (B) membro direito foi removida do embrião. (C) Pinça realizada pela mão esquerda segurando o embrião constante no prato. Setas indicam plano de dissecção (D) pulmão embrionárias está posterior ao coração (removido) E anterior à coluna vertebral. Esta figura mostra os pulmões após a remoção de pele e coração. (E) a remoção Faringe permite a separação do pulmão intacto do embrião. (F) de tecido da faringe e esôfago Extraneous foram cortadas fora. Dissecados pulmão E12.5 embrionárias com traquéia e laringe intacta é mostrado. (Cr) lobo cranial, (Med) lobo Medial, (Ca) lobo caudal, (Acc) lobo acessório, (Le) lobo esquerdo. <img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. FGF9 induz expansão do mesênquima ea dilatação do epitélio no pulmão cultivadas in vitro. (AC) E12.5 pulmão é cultivada por 48 horas na ausência de FGF9. Observe o aumento da ramificação. (DF) pulmão E12.5 crescido por 48 horas em presença de FGF9. Observe a dilatação do epitélio e mesênquima logo após 24 horas de cultura (E). Após 48 horas (F), o efeito sobre o epitélio é ainda mais pronunciada. Barra de escala: AF M 400 4. O protocolo de texto completo para essa abordagem experimental está disponível em <a href="http://springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-019-5_5">Protocolos Springer</a> .

<ol><li>Alescio, T., Cassini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+in+vitro+of+tracheal+buds+by+pulmonary+mesenchyme+grafted+on+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium.</a> J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).</li>
<li>Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of lung morphogenesis.</a> Mech Dev. 92, 55-81 (2000).</li>
<li>Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+in+mammalian+organ+development%3A+differentiation+of+cultured+lung+and+pancreas+rudiments+during+spaceflight%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight.</a> J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).</li>
<li>Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+FGF9+on+epithelium+and+mesenchyme+in+mouse+embryonic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung.</a> Dev Biol. 293, 77-89 (2006).</li>
<li>Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li>
<li>Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+mouse+lung+morphogenesis+and+type+II+cytodifferentiation+in+serumless%2C+chemically+defined+medium+using+prolonged+in+vitro+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures.</a> Cell Differ. 24, 105-117 (1988).</li>
<li>Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epidermal+growth+factor+expression+in+early+mouse+embryo+lung+branching+morphogenesis+in+culture%3A+antisense+oligodeoxynucleotide+inhibitory+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy.</a> Dev Biol. 158, 555-559 (1993).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

cultura do mouse pulmão embrionário, um sistema para avaliar os mecanismos moleculares de ramificação

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Especificação de pulmão primordial, assim como morfogênese de ramificação, ea formação de várias linhagens de células pulmonares requer uma interação específica da endoderme pulmão com seu mesênquima circundante e mesotélio. Mesênquima pulmonar tem se mostrado ser a fonte de sinais indutivos para morfogênese de ramificação de pulmão. Epitélio-mesenquimais-mesothelial interações também são fundamentais para morfogênese pulmão embrionário. Cultura de órgão embrionário de pulmão é um sistema muito útil para estudar interações epitélio-mesenquimais. Ambos epiteliais e mesenquimais procede morfogênese em condições específicas que podem ser facilmente manipulados neste sistema (na ausência de influência materna e do fluxo sanguíneo). Mais importante ainda esta técnica pode ser facilmente feito em um serumless, meios de cultura quimicamente definido. Ganho e perda de função pode ser conseguido usando proteínas expressas, vetores virais recombinantes e / ou análise de linhagens de camundongos transgênicos, RNA antisense, bem como knockdown do gene RNA de interferência.

Cultura de órgão embrionário de pulmão é um sistema muito útil para estudar interações epitélio-mesenquimais. Ambos epiteliais e mesenquimais procede morfogênese em condições específicas que podem ser facilmente manipulados neste sistema.

Cultura do mouse pulmão embrionário, um sistema para avaliar os mecanismos moleculares de Ramificação

A especificação primordial do pulmão, bem como a morfogênese ramificada e a formação de diversas linhagens celulares pulmonares, requerem uma interação específica de...

Neste vídeo, é demonstrado um método para a dissecação e cultura de pulmões embrionários de camundongo. O procedimento começa com a coleta de embriões em E 11,5 ou E 12,5. Em seguida, os embriões são abertos e os pulmões são extraídos.Os pulmões são então cultivados em uma interface líquido-ar e incubados conforme o cultivo. Alterações no crescimento e na ramificação do mesênquima e do epitélio do pulmão embrionário em resposta a tratamentos específicos podem ser observadas usando um microscópio estereoscópico. Olá, sou David War Burton.Coordeno o programa de biologia do desenvolvimento e medicina regenerativa no Instituto de Pesquisa Ban, Hospital Infantil de Los Angeles. E sou Jan Carro, pós-doutoranda sênior no Laboratório da Dra. War Burton. Hoje vamos mostrar uma técnica para isolar pulmões de camundongos embriões e colocá-los em cultura de órgãos.Essa técnica evoluiu a partir da descrição original de Tina Jaco Halkin e Pablo, que nos trouxeram na Escola de Odontologia da USC há cerca de 20 anos. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a morfogênese da ramificação do embrião. Então, vamos começar.No dia 11,5 ou 12,5 pós-coital, posicione um camundongo prenhe sacrificado com dióxido de carbono sob uma cabine de fluxo laminar, com a barriga voltada para cima. Aspergir com etanol 70%. Faça uma incisão no abdômen.Em seguida, segurando as patas traseiras do animal, remova a pele puxando-a para cima. Abra a cavidade peritoneal e remova o útero. Coloque o útero em um tubo cônico de 50 mililitros contendo solução salina balanceada de Hanks fria ou HBSS e agite suavemente por dois minutos para remover o sangue.Em seguida, transfira o útero para uma placa de Petri sob um microscópio estereoscópico de dissecação. Usando tesoura de mola, corte a parede uterina para liberar os embriões. Depois, com uma colher perfurada, colete os embriões e coloque-os em uma placa de Petri contendo HBSS e mantenha em gelo.Continue trabalhando sob o microscópio estereoscópico de dissecação e inicie a dissecação dos pulmões embrionários. Comece colocando o embrião sobre o seu lado esquerdo. Usando pinças, remova o membro anterior direito segurando as pinças na mão esquerda.Corte o embrião começando pela abertura da extremidade e remova a pele. Este passo permitirá visualizar os órgãos internos e localizar o coração e os pulmões para o próximo passo. Remova o coração.Os pulmões embrionários estão localizados posteriormente ao coração e anteriormente à coluna vertebral. Em seguida, separe o pulmão intacto do embrião. Depois, remova os tecidos excedentes e o esôfago.Uma vez que os pulmões tenham sido removidos, utilize uma pipeta estéril para transferi-los para uma placa de Petri contendo HBSS frio sobre gelo. Adicione a cada poço de uma placa de poliestireno sem clone delta entre 0,5 e um mililitro de D-M-E-M-F 12 suplementado com 50 unidades por mililitro de penicilina-estreptomicina. Em seguida, coloque uma membrana de policarbonato nucleopor cimeira do meio, com o lado brilhante para baixo e o lado áspero para cima.Usando uma pipeta de transferência estéril, coloque um pulmão embrionário dissecado sobre a membrana de policarbonato nucleoporosa. Com o auxílio do microscópio estereoscópico, ajuste a posição do pulmão embrionário. O pulmão embrionário deve ter uma traqueia intacta posicionada em linha reta, conforme mostrado aqui.Isso garante que todos os pulmões tenham a mesma pressão interna; transfira a placa para uma incubadora de células e cultive pelo tempo desejado. Aqui, pulmões de E 12,5 foram cultivados na presença ou ausência de FGF nove. FGF nove é um membro da família de fatores de crescimento de fibroblastos que induz a expansão do mesênquima e a dilatação do epitélio em pulmões cultivados in vitro após 48 horas.Na ausência do FGF nove, observa-se um aumento da ramificação. Essas imagens são fotografias do pulmão embrionário obtidas com microscópio estereoscópico. Em contraste, pulmões cultivados por 48 horas na presença do FGF nove apresentam epitélio dilatado e mechy.Após 24 horas de cultivo. Após 48 horas, o efeito sobre o epitélio é ainda mais acentuado. Assim, acabamos de mostrar como preparar culturas de órgãos a partir de pulmão de camundongo embrionário.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de remover o pulmão do embrião o mais rápido possível para reduzir a deterioração do tecido. Então, obrigado por assistir. Esperamos que você encontre esta técnica útil.Boa sorte com seus experimentos.

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