Cultura Rápida de Melanócitos Murinos Primários e Fibroblastos: Isolamento de Melanócitos e Fibroblastos de Amostra de Pele Murina Inteira

- A pele consiste em várias células que preenchem suas diferentes camadas. Os melanócitos, as células produtoras de melanina, localizam-se na junção epidérmica-dérmica, enquanto os fibroblastos, as células geradoras de tecido conjuntivo, residem na derme.

Para isolar rapidamente melanócitos e fibroblastos, comece pegando o tronco de um filhote de camundongo sacrificado. Corte a pele ventralmente ao longo do comprimento do tronco. Retire a pele que contém a camada epidérmica e dérmica e pique o tecido em pequenos pedaços.

Agora, trate com um tampão de digestão contendo enzimas tripsina e colagenase que degradam a matriz extracelular, liberando as células em suspensão. Centrifugue para peletizar as células e descartar o sobrenadante. Ressuspenda as células em meio melanócito e transfira a suspensão para uma placa multipoços.

Durante a cultura, a maioria dos fibroblastos adere ao fundo do poço, enquanto os melanócitos e outras células epidérmicas permanecem em suspensão. Aspire as células suspensas e adicione meios específicos de fibroblastos à cultura de fibroblastos para promover seu crescimento. Transfira a suspensão aspirada para um poço revestido de colágeno fresco para ajudar na formação de uma cultura aderente.

Suplemente com geneticina, um antibiótico, e adicione meios de crescimento de melanócitos frescos. A geneticina elimina seletivamente quaisquer fibroblastos remanescentes, enquanto o meio promove o crescimento dos melanócitos em relação a outros tipos de células epidérmicas. No protocolo a seguir, isolaremos melanócitos e fibroblastos da pele de filhotes murinos.

- Em um gabinete de fluxo laminar, role brevemente o tronco de cada camundongo sacrificado em uma placa de Petri estéril contendo 70% de etanol. Remova o camundongo do etanol e coloque-o em uma placa de Petri estéril vazia. Em seguida, esterilize a tesoura cirúrgica em etanol a 70%. Use essas tesouras para fazer uma incisão na pele do lado ventral do tronco, começando pelo pescoço e continuando até a cauda. Usando uma pinça estéril, retire a pele do tronco do camundongo e remova o excesso de tecido adiposo do lado dérmico da pele.

Coloque a pele, com a derme voltada para baixo, em um prato de 6 poços contendo 3 mililitros de 1x solução antibiótica/antimicótica. Incube em temperatura ambiente por 2 a 3 minutos. Em seguida, ligue o picador de lenços de papel e ajuste as configurações para as mostradas aqui.

- Certifique-se de ter cuidado ao instalar a lâmina do picador de lenços de papel e ao operar a máquina.

- Transfira a pele, com o lado da derme para baixo, para um picador de lenços de papel estéril e passe a pele completamente pelo picador de lenços de papel três vezes. Depois disso, transfira a pele homogeneizada para um tubo cônico estéril de 15 mililitros contendo 3 mililitros de tampão de digestão da pele.

Usando uma micropipeta P1000, misture a suspensão resultante pipetando vigorosamente para cima e para baixo dez a quinze vezes. Tampe o tubo cônico e incube a amostra em banho-maria a 37 graus Celsius por 15 minutos, certificando-se de inverter o tubo a cada 3 a 5 minutos.

Em seguida, centrifugue o tubo em um rotor de balde oscilante a 750 x g em temperatura ambiente por 5 minutos para granular as células do homogeneizado da pele. Use uma micropipeta P1000 para remover lenta e completamente o tampão de digestão da pele, tomando cuidado para não perturbar o pellet.

- Certifique-se de aspirar todo o tampão de digestão da pele. Se você estiver tendo problemas, lave o pellet celular com 2 a 3 mililitros de meio melanócito e repita a centrifugação e remova o excesso de tampão de digestão da pele.

- Em seguida, ressuspenda completamente o pellet celular em 1 mililitro de meio melanócito, pipetando para cima e para baixo quinze a vinte vezes com uma pipeta P1000. Transfira a solução celular resultante gota a gota para um poço não revestido em um prato de 6 poços que contenha 1 mililitro de meio de melanócitos. Incubar o homogeneizado de pele plaqueada em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 40 minutos.

Depois disso, transfira o sobrenadante de cultura do prato não revestido para um poço de um prato de 6 poços revestido de colágeno pré-lavado. Adicionar G418 ao meio de modo a que a concentração final seja de 100 nanogramas por mililitro. Adicione 2 mililitros de meio de fibroblastos a um poço do prato não revestido, agora contendo fibroblastos aderentes. Incube ambas as culturas durante a noite em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Após 16 a 24 horas de incubação, aspirar separadamente o meio e quaisquer detritos de cada cultura. Lave cada prato duas vezes, usando 1 mililitro de PBS para cada lavagem. Em seguida, adicione 2 mililitros de meio de melanócitos frescos à cultura de melanócitos e adicione 2 mililitros de meio de fibroblastos frescos à cultura de fibroblastos.