Preparação de vírion de poliomavírus de células de Merkel recombinante (MCPyV): uma técnica para produzir vírion MCPyV recombinante de alto título

- O poliomavírus de células de Merkel, ou MCPyV, é um oncovírus de DNA de fita dupla com um genoma circular que causa o carcinoma de células de Merkel, um tipo de câncer de pele. Para preparar vírions MCPyV, primeiro, trate uma cultura aderente de células de empacotamento com um coquetel contendo um agente de transfecção, o genoma viral e dois plasmídeos de expressão que codificam proteínas necessárias para promover a replicação viral.

Durante a incubação, o reagente de transfecção forma lipoplexos com os plasmídeos, facilitando sua entrega nas células de embalagem. Uma vez dentro do núcleo, a maquinaria celular permite a expressão dos genomas virais e plasmidiais. Os plasmídeos de expressão codificam proteínas de antígeno de tumor grande e antígeno de tumor pequeno. Essas proteínas se translocam para o núcleo e impulsionam a replicação do DNA viral. Posteriormente, o genoma viral codifica proteínas estruturais do capsídeo. Essas proteínas se movem para o núcleo e ajudam na montagem de vírions recombinantes.

Em seguida, colha as células cultivadas. Trate-os com uma solução contendo detergente e DNase. O detergente lisa as células para liberar os vírus. A DNase degrada qualquer DNA plasmídico livre da suspensão. Centrifugue para separar os detritos celulares no pellet. Colocar o sobrenadante contendo vírus num tubo que contenha um meio de gradiente de densidade adequado. Centrifugar para obter fracções concentradas ricas em vírion no meio gradiente.

No protocolo a seguir, mostraremos a preparação de vírions MCPyV recombinantes de alto título usando células 293TT.

- No final da tarde ou à noite, semeie 6 milhões de células 293TT-28 em um prato de 10 centímetros contendo meio DMEM suplementado. Incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Na manhã seguinte, certifique-se de que as células estejam cerca de 50% confluentes. Em seguida, transfecte as células com 66 microlitros de reagente de transfecção, 12 microgramas de DNA R17b isolado MCPyV religado, 8,4 microgramas de plasmídeo de expressão ST pMtB e 9,6 microgramas de plasmídeo de expressão LT pADL. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

No dia seguinte, quando as células transfectadas estiverem quase confluentes, tripsinize as células e transfira-as para um prato de 15 centímetros para expansão contínua. Quando esse prato se tornar quase confluente, transfira as células para três novos pratos de 15 centímetros. Quando esses novos pratos se tornarem quase confluentes, colha as células conforme descrito no protocolo de texto. Centrifugue a 180 x g em temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e adicione 1 volume celular de DPBS-Mg.

Adicione 25 sulfato de amônio micromolar, seguido por 0,5% de Triton X-100, 0,1% de Benzonase e 0,1% de uma DNase dependente de ATP. Misture bem e incube a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, deixe esfriar a mistura no gelo por 15 minutos. Em seguida, adicione 0,17 volume de cloreto de sódio. Misture e incube no gelo por mais 15 minutos. Centrifugue a 12000 x g a 4 graus Celsius por 10 minutos. Se o sobrenadante não estiver límpido, inverter suavemente o tubo e repetir a centrifugação.

Depois disso, transfira o sobrenadante para um novo tubo. Ressuspenda o pellet em um volume de DBPS suplementado com 0,8 moles de cloreto de sódio. Centrifugue a 12000 x g a 4 graus Celsius por 10 minutos. Se o sobrenadante não estiver límpido, inverter suavemente o tubo e repetir a centrifugação. Combinar os dois sobrenadantes e centrifugar novamente a 12000 x g a 4 graus Celsius durante 10 minutos.

Em seguida, use uma pipeta para depositar gradientes de iodoxonais em tubos polialômeros de 5 mililitros de paredes finas, conforme descrito no protocolo de texto. Carregue 3 mililitros do sobrenadante clarificado contendo vírus no topo do gradiente iodoxonal preparado. Centrifugue com um rotor SW55ti a 234.000 x g e a 16 graus Celsius por 3,5 horas, certificando-se de definir a aceleração e a desaceleração para lentas. Após a conclusão da ultracentrifugação, coletar 12 frações em tubos siliconizados.