Ensaio de formação de colônias de queratinócitos: um ensaio in vitro para avaliar a capacidade dos queratinócitos de se transformarem em colônias

- O ensaio de formação de colônias determina a capacidade de células individuais de proliferar e formar colônias. Comece com uma pele dorsal de camundongo excisada em uma placa de cultura. Raspe o tecido subcutâneo e a gordura do lado ventral da pele. Trate o tecido com uma solução de digestão. As enzimas proteolíticas na solução degradam a matriz extracelular, induzindo a dissociação das células epidérmicas.

Raspe suavemente a camada epidérmica para liberar as células e cabelos dissociados em um meio de colheita. Filtre a suspensão através de um filtro apropriado para prender os pelos ou quaisquer detritos e obter uma suspensão unicelular de células epidérmicas. Transfira o volume desejado desta suspensão celular para uma placa revestida de colágeno contendo uma camada aderente de células alimentadoras com crescimento interrompido. Suplemento com um meio adequado que favoreça a sobrevivência dos queratinócitos.

Durante a cultura, os queratinócitos se ligam à camada de alimentação. Além disso, essas células alimentadoras secretam fatores de crescimento e sintetizam proteínas da matriz extracelular que suportam o crescimento de queratinócitos. Dependendo da capacidade proliferativa dos queratinócitos individuais, eles começam a formar colônias. Remova a mídia e conserte as colônias. Manchar as células com um corante adequado para detectar as colônias para contagem. No protocolo a seguir, realizaremos o ensaio clonogênico de queratinócitos primários colhidos de camundongos adultos após tratamento com compostos de teste.

- Depois de colher amostras de pele dorsal de camundongos adultos sacrificados, use uma pinça autoclavada e um bisturi para colocar uma pele dorsal de cada vez, com o lado piloso para baixo, em uma placa de Petri fina e raspe o tecido subcutâneo, incluindo a gordura do lado ventral do tecido da pele, até que o tecido seja semi-translúcido.

Coloque esta pele raspada no PBS até que todas as outras peles restantes sejam processadas. Em seguida, use um bisturi para cortar as amostras de pele em tiras de 0,5 x 1 a 1,5 centímetro. Coloque as tiras com o lado peludo para cima em uma placa de Petri estéril antes de flutuar as amostras com o lado peludo para cima na superfície de uma solução de PBS de 20 mililitros mais 2x gentamicina suplementada com 0,25% de tripsina em uma placa de Petri de plástico de 100 x 20 milímetros por 2 horas a 32 graus Celsius.

No final da incubação, coloque uma placa de Petri quadrada de plástico estéril contendo 15 mililitros de meio de colheita em uma inclinação de 30 graus e use uma pinça curva para transferir cuidadosamente uma tira de pele flutuante para a placa. Segurando uma nova lâmina de bisturi em um ângulo perpendicular à pele e usando força suficiente, mas não excessiva, raspe a epiderme e os pelos da amostra para o meio.

Quando todas as tiras tiverem sido raspadas, decante cuidadosamente o sobrenadante contendo células epidérmicas em um frasco estéril de 60 mililitros contendo uma barra de agitação magnética de 1,5 polegada e enxágue a placa de Petri com meio de colheita adicional para coletar quaisquer células epidérmicas restantes.

Traga o volume final no frasco para 30 mililitros com meio fresco e mexa a solução de células epidérmicas a 100 rotações por minuto por 20 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação de agitação, em uma cabine de biossegurança, remova a barra de agitação e filtre a solução celular através de um filtro de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros.

Use uma pinça e, em seguida, uma pipeta para pressionar os cabelos e os materiais do estrato córneo através do filtro para manipular o tecido para liberar as células ciliadas presas e use mais 5 mililitros de meio de colheita para liberar as células ciliadas presas restantes no tubo.

- É fundamental que as células epidérmicas e os cabelos sejam manipulados de modo a liberar as células dos folículos pilosos.

- Aumente o volume total no tubo para 50 mililitros com meio fresco e colete o filtrado celular por centrifugação. Ressuspenda o pellet em 5 mililitros de meio de colheita fresco e cerca de 20 triturações com uma pipeta de 5 mililitros. Pegue 0,5 mililitros da diluição 1:20 e transfira para um tubo de microcentrífuga de 2 mililitros.

Depois de misturar a amostra com cuidado, retire 200 microlitros do tubo de microcentrífuga e misture delicadamente com um volume igual de solução de Trypan Blue a 0,4%. Misture suavemente esta solução três vezes e transfira as células para um hemacitômetro para contagem de queratinócitos nucleados.

Marque todas as células azuis escuras como células não viáveis e marque pequenas células rosadas douradas como células viáveis. A viabilidade média é de cerca de 80%, e o rendimento final de queratinócitos por camundongo deve ser de cerca de 30 milhões de células viáveis. Após a contagem, colete as células com outra centrifugação e, para cultura em massa, ressuspenda 2 a 4 vezes 10 para o sexto queratinócitos viáveis por placa de Petri de 35 milímetros em 2 mililitros de meio de cultura celular.

Para um ensaio de formação de colônias clonogênicas, ressuspenda as células em 1 vezes 10 para o terceiro queratinócito por 4 mililitros de meio E de William modificado com suplementos e concentração sérica por placa de Petri de 60 milímetros revestida com colágeno em camadas alimentadoras de camundongo suíço 3T3 irradiadas por raios-X.

Para cultura em massa, cultive as culturas a 32 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono pelo período de cultura de células apropriado, trocando o meio 24 horas após a semeadura inicial para cultura em massa e 3 vezes por semana a partir de então.

Ao final da cultura clonal, aspirar o meio e fixar as colônias em formol tamponado a 10% durante a noite à temperatura ambiente. Na manhã seguinte, manche as colônias com 0,5% de rodamina B em água autoclavada por uma hora antes de enxaguar a louça em água fria autoclavada até que a água saia limpa. Em seguida, incline os pratos em suas tampas para secar antes de contar as colônias.