Transgênese baseada em vetor miniCoopR: uma técnica para rastrear genes indutores de melanoma em modelo de tumor de peixe-zebra

- No peixe-zebra, o melanoma surge da transformação maligna dos melanócitos - as células produtoras de melanina. Para estudar o início do melanoma, use um modelo de peixe-zebra transgênico com deficiência de melanócitos e propenso a melanoma. Este modelo não possui melanócitos devido a uma mutação de perda de função em seu promotor mitfa específico para melanócitos.

Comece pegando um embrião unicelular deste modelo transgênico em uma placa de ágar. Co-injete uma mistura contendo um vetor miniCoopR baseado em transposon e mRNAs da enzima transposase no embrião. O vetor contém um de genes, compreendendo um minigene mitfa portador de promotor acoplado a um gene candidato imprensado entre dois elementos de transposon.

Os mRNAs co-injetados codificam proteínas transposase. Essas proteínas atuam nos elementos do transposon e catalisam a excisão do do vetor miniCoopR, seguida de sua integração no DNA genômico do embrião. Posteriormente, o promotor do conduz a expressão do gene mitfa e do gene candidato de interesse.

O gene mitfa suporta o resgate e o desenvolvimento dos melanócitos, enquanto o gene candidato, se oncogênico, induz o aparecimento do melanoma. Rastreie o peixe-zebra desenvolvido. Peixes transgênicos com melanócitos resgatados desenvolvem pigmentação de melanina, enquanto aqueles com melanomas carregam lesões pigmentadas elevadas.

No protocolo a seguir, mostraremos a triagem de modificadores de início de melanoma usando vetores miniCoopR em modelos transgênicos de tumor de peixe-zebra.

- Para gerar construções para injeção, comece criando clones de entrada intermediária do Gateway por PCR, amplificando o quadro de leitura aberto completo de genes de interesse e recombinando em pDONR221. Em seguida, use a tecnologia Multisite Gateway para recombinar o promotor de mitfa específico do melanócito, o gene de interesse e o sinal de poliadenilação no vetor miniCoopR para colocar os genes de interesse sob o controle do promotor de mitfa.

Injete 25 picogramas de cada clone junto com 25 picogramas de mRNA de transposase Tol2 em embriões de peixe-zebra tricelulares, transgênicos e triplo-homozigotos. Os animais mutantes mitfa-BRAF-p53 são deficientes em melanócitos e propensos à transformação e formação de melanoma. Junto com o gene de interesse, o vetor miniCoopR contém um minigene mitfa de resgate. Assim, animais injetados com sucesso desenvolverão melanócitos resgatados, que expressam o gene de interesse.

Incube os embriões injetados a 28,5 graus Celsius. Às 24 horas após a fertilização, ou hpf, remova todos os embriões mortos. Às 72 horas após a fertilização, usando um microscópio de dissecação sob luz incidente contra um fundo branco, selecione animais transgênicos com melanócitos resgatados.

Quando os animais atingirem 4 dias após a fertilização, transfira-os para tanques de 3 litros no viveiro da instalação de peixe-zebra. Aos 2 meses de idade, selecione os animais com pelo menos uma área de resgate de melanócitos maior que 4 milímetros quadrados. Rastreie os animais selecionados semanalmente quanto à presença de tumores. Isole animais portadores de tumor para estudo.

Desenhe curvas de sobrevida livre de melanoma com idade e semanas na abscissa e porcentagem de sobrevida livre de melanoma na ordenada. Compare animais com melanócitos que expressam um gene de interesse para controlar animais que expressam EGFP em melanócitos. Use um teste de log-rank para determinar se as duas curvas são estatisticamente diferentes.