JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 3:45 min • April 30th, 2023
- Os fatores de transcrição são proteínas que contêm domínios de ligação ao DNA. Eles se ligam a sequências específicas de DNA e ajudam a regular a expressão gênica nas células. Para detectar a expressão do fator de transcrição em melanócitos associados a escamas, primeiro colha escamas dorsais pigmentadas escuras de um peixe-zebra anestesiado. Fixe as escamas e trate-as com uma solução de permeabilização para tornar os melanócitos individuais permeáveis.
Trate com uma solução de alvejante para remover os grânulos de pigmento de melanina escura das células. Este processo de branqueamento elimina as chances de sinais de fundo associados ao pigmento durante as etapas de coloração subsequentes. Incube com uma solução de bloqueio contendo proteínas para bloquear locais de ligação de proteínas não específicos na superfície celular.
Agora, trate a amostra com os anticorpos primários desejados. Esses anticorpos se ligam aos seus fatores de transcrição alvo dentro das células. Em seguida, rotule a amostra com anticorpos secundários marcados com fluorescência específicos para os anticorpos primários. Além disso, trate a amostra com um corante de ligação de DNA fluorescente apropriado para corar os núcleos das células. Use um microscópio de fluorescência para detectar emissões fluorescentes brilhantes dos complexos fator de transcrição-anticorpo e núcleos celulares.
No protocolo a seguir, mostraremos a imunomarcação de melanócitos associados à escama dorsal que expressam o fator de transcrição indutor de melanócitos-A, ou mitfa, em um peixe-zebra transgênico.
- Para realizar a imunocoloração, anestesiar o peixe em 0,17 miligramas por mililitro de tricaína. Com a luz incidente sob um microscópio de dissecação, use pinças afiadas de ponta fina para arrancar as escamas dorsais, tomando cuidado para não danificar a metade da escama que contém melanócitos. Coloque as escamas diretamente da pinça em 1 mililitro de fixador e incube em temperatura ambiente, enquanto gira, por mais ou igual a 2 horas. Transfira o peixe para a água dos peixes e monitore o peixe para confirmar a recuperação bem-sucedida.
Para branquear melanócitos pigmentados, primeiro, lave as escamas fixas em PBST duas vezes por 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 1 mililitro de solução de alvejante recém-feita e cubra com parafilme ou travas para evitar que o gás estoure os tubos. Continue descolorindo até que o pigmento desapareça. Em seguida, lave em PBST quatro vezes por 5 minutos em temperatura ambiente.
Incubar durante pelo menos 30 minutos em solução em bloco. Em seguida, incube com cerca de 400 microlitros de anticorpo primário em solução em bloco durante a noite em temperatura ambiente. No dia seguinte, lave a balança três vezes por 30 minutos em PBST em temperatura ambiente. Incubar com anticorpo secundário durante 2 horas a pernoite à temperatura ambiente.
Após a coloração com DAPI, aplique uma gota de vectashield em uma lâmina de vidro e monte as escamas de forma que o lado côncavo das escamas fique voltado para baixo contra a lâmina. Coloque uma lamínula de vidro sobre as amostras. Use esmalte transparente para selar as bordas e observe as lâminas sob um microscópio de fluorescência.