Name: Comportamento de gravação em multicelulares Myxococcus xanthus Os biofilmes usando lapso de tempo Microcinematography (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-06T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprenda microcinematografia time-lapse para estudar comportamento de enxame em biofilmes de Myxococcus xanthus usando gaxetas de silicone reutilizáveis. Este método econômico mantém hidratação por mais de uma semana.

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Esta pesquisa foi possível graças a um prêmio de carreira National Science Foundation (MCB-0746066, caracterização de ativadores de transcrição que regulam o comportamento emergente) para RDW Somos gratos a LJ Shimkus, Goldman BS, Suen G., Singer M., Welch LG, Murphy KA, e Taylor HG para discussões úteis e comentários sobre o manuscrito.

Suprimentos necessários: <ul><li> Klett metros </li><li> Pipeta e dicas </li><li> 2,5 ml tubos de microcentrífuga </li><li> Microcentrífuga </li><li> CTTYE mídia: <ul><li> Casitone 1,0% (Difco Laboratories), extrato de levedura 0,5% (Difco Laboratories), </li><li> 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4 </li></ul></li><li> TPM mídia: <ul><li> 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4 </li></ul></li><li> Agarose </li><li> Banho-maria regulado a 55 ° C </li><li> Microscópio de lâminas de vidro </li><li> Grandes lamínulas de vidro </li><li> 2 x 2 cm, 0,5 mm de espessura de silicone junta de borracha (Grace Bio-Lab Inc.) </li><li> Parafilme (ou fita rotulagem) </li><li> Fórceps </li><li> Pequenos grampos da pasta </li><li> Micro-amostragem de pipetas (Fisher) </li><li> 100 gorjeta de copo descartável mL (Fisher) </li><li> Kimwipes </li></ul> Parte 1: preparação celular Comece por criar um ambiente estéril. <ul><li> Local de trabalho limpo, luvas don, e gravador de luz. </li></ul><ol><li> Iniciar uma cultura de células durante a noite através da inoculação em um frasco contendo caldo CTTYE e incubadas no escuro a 32 ° C, sob agitação vigorosa. </li><li> Uma vez que a cultura atingiu uma densidade de 5 x 10 8 células / ml, pipetar 1 ml de células em um tubo de microcentrífuga de 2,5 ml. </li><li> Pellet células por centrifugação por 2 min a 16.000 xg (ou velocidade máxima). </li><li> Decantar e descartar o sobrenadante. </li><li> Lavar pellet celular com 1 ml TPM (sal equilibrada, nutritiva livre de mídia). <ul><li> re-suspensão e vortex </li></ul></li><li> Re-pellet células girando por 2 min a 16.000 xg (ou velocidade máxima). </li><li> Decantar e descartar o sobrenadante. ETAPA CRÍTICA </li><li> Completamente re-suspender pellet em 100 mL de mídia TPM usando uma combinação de pipetagem e vórtice. IMPORTANTE: Este passo garante que não existem aglomerados de células deixadas no tubo. Isso pode demorar um pouco. </li><li> Definir as células de lado em temperatura ambiente enquanto prepara os pratos ensaio de monitoramento. </li></ol> Parte 2: Preparação Agar <ol><li> Prepare 50 ml de ambos TPM (teste de mídia) e CTTYE (disco nutritivo) meios de comunicação. </li><li> Adicionar 0,5 g de agarose a cada (agarose é menos de difracção de agar). </li><li> Autoclave para esterilizar. </li><li> Após a esterilização, manter a media de 55 ° C em uma incubadora (ou banho-maria) durante a construção dos complexos placa de monitoramento do ensaio. </li></ol> Parte 3: Construção Disk Nutritivo <ol><li> Coloque uma junta de borracha estéril 0,5 mm de espessura de silicone em cima de uma chama-esterilizados lâmina de vidro, formando um pequeno poço. </li><li> Pipeta ~ 300 ml dos 55 ° C CTTYE media / agarose para o bem criado pela junta sobre a lâmina e que contém o disco nutritivo. A mídia CTTYE / agarose deve monte acima. </li><li> Coloque um slide chama esterilizados (sem junta) no topo da mídia CTTYE / agarose. IMPORTANTE: Este slide deve ser estabelecido em um ângulo para evitar a formação de bolhas. </li><li> Uma vez que o slide está no lugar, apertar o complexo juntamente com grampos da pasta mini - um de cada lado. </li><li> Coloque o complexo cortada a 4 ° C e permitir que a mídia CTTYE / agarose para definir. Isso geralmente leva cerca de 5 min. </li></ol> Parte 4: Preparação de Ensaio Tracking - Configurar Placa Complexos Montar os componentes, preparar os complexos de slides, coloque o disco nutritivo, despeje a mídia TPM / agarose, complexos de chapa separada e seca, as células da placa, e montar complexos de monitoramento da placa de ensaio. Montar componentes placa complexo <ol><li> Para cada complexo, chama esterilizadas uma lâmina de vidro </li><li> Coloque uma junta autoclavado em cima do slide e reserve (esterilizado lado para cima). Isto irá formar a parte inferior do ensaio. </li><li> Chama esterilizar uma tampa de vidro slip e colocá-lo em cima de um segundo slide de vidro de microscópio envolto com fita rotulagem (ou Parafilm) e reserve (esterilizado lado para cima). Isso é usado como um slide de apoio para manter as lamelas de rachar. Isto irá formar a parte superior do ensaio. </li><li> Chama esterilizar uma lâmina de microscópio terceiro copo e reserve (esterilizado lado para cima). Isso será usado para achatar a agarose. IMPORTANTE: Certifique-se que as juntas formar uma vedação com o vidro pressionando-o com uma pinça, caso contrário, a mídia / agarose pode secar. </li></ol> P rendas disco nutritivo IMPORTANTE: As etapas de 5 a 10 deve ser feito para um complexo de lâmina de cada vez, caso contrário a mídia / agarose poderia começar a solidificar, resultando em qualidade de filme ruim. <ol start="5"><li> Remover o formulário de disco nutritivo complexo de 4 ° C (etapa 5 da parte 3) e erguer para além dos slides expondo a CTTYE agora solidificados / agarose. </li><li> Remover um 1 'disco nutritivo' mm de diâmetro da mídia CTTYE / agarose bem descrito acima, usando uma pipeta de amostragem micro-com uma ponta de vidro 100 ml descartáveis ​​e coloque-o no poço criado pela junta na lamínula (passo 3 acima) . </li></ol> Preparar placas ETAPA CRÍTICA <ol start="7"><li> Pipeta ~ 300 ml dos 55 ° C TPM media / agarose para o bem criado pela junta na lamínula e que contém o disco nutritivo. A mídia TPM / agarose deve monte acima. ETAPA CRÍTICA </li><li> Coloque o slide chama esterilizadas sem junta (a partir do passo 3) no topo da mídia TPM / agarose. IMPORTANTE: Este slide deve ser estabelecido em um ângulo para evitar a formação de bolhas. </li><li> Uma vez que o slide (a partir do passo 5) estiver no lugar, apertar o complexo juntamente com grampos da pasta mini - um de cada lado. </li><li> Coloque o complexo cortada a 4 ° C e deixe o media / agarose para definir. Isso geralmente leva cerca de 5 min. </li></ol> Pratos separados e secos IMPORTANTE: Para evitar que o media / agarose de secar, os passos 11 a 20 só deve ser realizada em um complexo de lâmina de cada vez. IMPORTANTE: Para melhores resultados, os passos 11 a 13 deve ser realizada a 4 ° C. <ol start="11"><li> Uma vez que a media / agarose tem, retire a grampos da pasta e aperte o final do complexo para soltar o slide tape-embrulhado. </li><li> Remove o slide envolto em fita e colocá-lo no banco para uso posterior. ETAPA CRÍTICA </li><li> Utilizando uma pinça como uma cunha, separe os lamínula / junta / media / agarose complexo a partir do slide de apoio (sem junta) e descartar slides de apoio. IMPORTANTE: Não use um movimento para separar os curiosos lamínula / complexo junta. Isto poderia resultar na quebra lamínula e / ou a degola media / agarose para o slide apoio. </li><li> Coloque a lamínula / junta / media / agarose complexo no slide tape-envolvido (a junta lateral-se) e remover a partir de 4 ° C. Coloque este complexo próximo a um queimador para permitir que toda a umidade evapore visível a partir do recém-expostas superfície media / agarose - não mais de 1 min. IMPORTANTE: Não deixe que a seca media / agarose por muito tempo, pois isso pode impactar o M. xanthus comportamento enxame. </li></ol> Células da placa ETAPA CRÍTICA <ol><li> Uma vez que o excesso de umidade tenha evaporado, pipetar 0,5 mL das células concentrado (passo 8 da parte 1) sobre a mídia / agarose aproximadamente 1 mm de distância do disco de nutrientes. IMPORTANTE: É extremamente importante certificar-se que as células são depositadas movendo a pipeta para baixo e depois para cima. Isso garante que o enxame será circular. IMPORTANTE: É extremamente importante para não tocar a ponta da pipeta para a mídia / agarose. Isso fará com que uma depressão na superfície e mudar o comportamento do M. xanthus enxame. DICA: Pressione a ponta da pipeta antes de se aproximar a mídia / agarose. Isso permitirá que uma gota de células para aparecer na parte inferior da ponta da pipeta e tornar mais fácil para depositar as células. </li><li> Quando as células são depositadas, coloque o seguinte complexo para o queimador para permitir que o local de célula para secar - não mais de 20 seg. </li></ol> Montagem do ensaio <ol><li> Uma vez que o local de células secou, ​​alinhar o complexo slide / junta (a partir do passo 1) com a junta sobre a lamínula / junta / media / agarose / celular complexo (a partir do passo 13) e pressione suavemente para formar uma vedação. ETAPA CRÍTICA </li><li> Limpe as superfícies da lâmina e cobrir com um slip Kimwipe para remover os resíduos deixados pelo Parafilm. O ensaio completo deve se parecer com a Figura 1. </li><li> Coloque o complexo de slides concluída no palco aquecida mantida a 32 ° C (deslizar para baixo, cubra escorregar) imediatamente após limpar abaixo (passo 15) para evitar a condensação formando formulário. Se a condensação se formou, vamos sentar complexa de slides no palco aquecida durante alguns segundos antes de iniciar o software de aquisição de imagem. </li><li> Escolha o objetivo apropriado (2X, 4X ou 10X). </li></ol> Parte 5: Preparação Filme t "STEP&gt; CRÍTICA <ol><li> Ligue a câmera e microscópio, e verificar os níveis de luz (certifique-se a luz não é muito intensa). Inicie o computador e abra o programa de aquisição de imagem. </li><li> Clique na janela de imagem ao vivo e foco do microscópio. A imagem deve ser semelhante ao observado na Figura 3. Observe a superfície do ágar uniforme. </li><li> Começar a adquirir as imagens. ETAPA CRÍTICA </li><li> Verifique regularmente o foco durante a primeira hora, como a mídia / agar tende a resolver fazendo com que o foco para drift. </li><li> Limpar a área de trabalho. </li><li> Uma vez que a aquisição da imagem está completa, transferir as imagens adquiridas para o armazenamento e quebrar o complexo slide por imersão em etanol 90% durante a noite. </li><li> Juntas autoclave para reutilização. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Ilustração dos desenhos animados do complexo placa TM. (A) mostra a complexa placa básica TM em vista explodida e seção transversal. (B) mostra o uso de juntas maiores. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Aglomerado de Microscopia. Cada nó microscópio (inset) consiste de um microscópio Nikon E400, objetivos, uma fase aquecida, uma câmera Insight, e um computador notebook. Cada nó é interligados em rede e ligados a um computador do controlador mestre. Dois dos nodos são criados com recursos de fluorescência, que consiste da fonte de luz e duas persianas EXFO Uniblitz. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Uma imagem de 20X de aparelhos de ensaio de monitoramento em tempo = 0. Barra de escala, 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Adaptabilidade do complexo placa TM. (A) uma imagem de 100X de M. xanthus deslizando sobre motilidade CTTYE em ágar 1,0%. (B) uma imagem de 20X de P. aeruginosa twitching motilidade. (C) uma imagem de S. 20X marcescens swarming motilidade. Ambos (B) e (C) foram testadas em LB em ágar 1,0%. (D) uma imagem de 40X de M. smegmatis deslizante motilidade em ágar LB em 0,5%. Esta imagem foi capturada usando a configuração de ensaio alternativos visto na Figura 1B. Vídeo 1. Um vídeo time-lapse de um enxame submetido ao ensaio de monitoramento. Video 2. Um vídeo time-lapse de um M. xanthus enxame onde 1% das células são fluorescente etiquetado. Alternando imagens de contraste de fase e fluorescentes foram capturados e sobrepostos para elucidar a posição de células fluorescentes dentro do enxame. Este vídeo foi capturado em CTTYE em ágar 1,0%. Vídeo 3. Um vídeo de lapso de tempo de M. xanthus motilidade deslizamento. Este vídeo foi capturado em CTTYE em ágar 1,0%. Video 4. Um vídeo de lapso de tempo de P. aeruginosa twitching motilidade. Este vídeo foi capturado em LB em ágar 1,0%. Video 5. Um vídeo de lapso de tempo de S. marcescens swarming motilidade. Este vídeo foi capturado em LB em ágar 1,0%. Video 6. Um vídeo de lapso de tempo de M. smegmatis deslizante motilidade. Este vídeo foi capturado em LB em ágar 0,5% utilizando a configuração do ensaio alternativa visto na Figura 1B.

<ol><li>Taylor, R. G., Welch, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+as+an+emergent+property+of+a+swarm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis as an emergent property of a swarm.</a> J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).</li>
<li>Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+of+Myxococcus+xanthus+During+Fruiting+Body+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation.</a> J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).</li>
<li>Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+pole-to-pole+oscillations+of+a+bacterial+gliding+motility+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein.</a> Science. 310, 855-857 (2005).</li>
<li>Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+surface+migration%2C+and+other+dynamic+behavior+in+bacterial+biofilms+revealed+by+digital+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging.</a> Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).</li>
<li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+as+microbial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li>
<li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+and+twitching+motility+are+necessary+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).</li>
<li>Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substratum-induced+morphological+changes+in+a+marine+bacterium+and+their+relevance+to+biofilm+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure.</a> J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).</li>
<li>Dworkin, M., Eide, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myxococcus+xanthus+does+not+respond+chemotactically+to+moderate+concentration+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients.</a> J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).</li>
<li>Dworkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactic+behavior+of+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tactic behavior of Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 154, 452-459 (1983).</li>
<li>Wu, S. S., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+expression+of+the+pilA+gene+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).</li>
<li>Bustamante, V. H., Martínez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Frz+signal+transduction+system+of+Myxococcus+xanthus+shows+the+importance+of+the+conserved+C-terminal+region+of+the+cytoplasmic+chemoreceptor+FrzCD+in+sensing+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals.</a> Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Lapso de tempo microcinematography (TM) tornou-se uma abordagem padrão para estudar a motilidade procarióticas 2-7. Tradicionalmente, a TM é realizado usando mechas de papel de filtro, pastilhas de ágar fina, ou placas de ágar como substrato 8-11. Estes métodos são adequados e de custo eficaz quando usado para gerar seqüências de imagens para ilustrações geral do movimento bacteriano. No entanto, se seqüências de imagens deve resultar na geração de dados reprodutíveis e quantitativamente rigoroso, ...

<table><tbody><tr><td>1,0% Casitone</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5% extrato de levedura</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipeta de microamostragem</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ponta descartável de vidro de 100 &amp;mu;l</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>junta de borracha de silicone de 2 x 2 cm e 0,5 mm de espessura</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

comportamento de gravação em multicelulares myxococcus xanthus os biofilmes usando lapso de tempo microcinematography

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

Um enxame da δ-proteobacterium Myxococcus xanthus contém milhões de células que funcionam como um movimento coletivo, coordenando através de uma série de sinais para criar complexos, padrões dinâmicos como uma resposta a estímulos ambientais. Estes padrões estão a organizar-auto e emergentes, não pode ser prevista observando o comportamento das células individuais. Usando um lapso de tempo de ensaio de rastreamento microcinematography, identificamos um padrão distinto emergente em M. xanthus chamado quimiotaxia, definido como o movimento dirigido de um enxame de um gradiente de nutrientes em direção a sua fonte de 1. A fim de caracterizar de forma eficiente via quimiotaxia lapso de tempo microcinematography, desenvolvemos um altamente complexo placa modificáveis ​​(figura 1) e construído um cluster de 8 de microscópios (Figura 2), cada um capaz de capturar vídeos de lapso de tempo. O ensaio é rigoroso o suficiente para permitir a replicação consistente de dados quantificáveis, e os vídeos resultantes nos permitem observar e acompanhar as mudanças sutis no comportamento enxame. Uma vez capturados, os vídeos são transferidos para um computador de análise / armazenamento com memória suficiente para processar e armazenar milhares de vídeos. A flexibilidade desta configuração tem se mostrado útil para vários membros da M. xanthus comunidade.

Para estudar<em&gt; Myxococcus xanthus</em&gt; Swarm comportamento, criamos um protocolo microcinematography lapso de tempo que podem ser modificados para ensaios diferentes. Emprega condições de crescimento padrão adaptado para microscopia, e produz resultados reproduzíveis pelo uso de barato, juntas de silicone reutilizável. Temos utilizado este método para quantificar a quimiotaxia multicelulares.

Comportamento de gravação em multicelulares Myxococcus xanthus Os biofilmes usando lapso de tempo Microcinematography

Um enxame da $\delta$-proteobactéria Myxococcus xanthus contém milhões de células que atuam como um coletivo, coordenando o movimento por meio de uma série de ...

O objetivo geral do experimento a seguir é desenvolver um ensaio de microcinematografia com lapso de tempo barato e com rigor suficiente para gerar resultados reprodutíveis e quantificáveis. Isso é alcançado mediante o uso de juntas de silicone reutilizáveis e de baixo custo para a construção de placas com meio agros ou lâminas de microscopia. Os resultados obtidos demonstram que esses complexos de placas permanecem hidratados e suficientemente oxigenados por mais de uma semana, em diversos tipos de meio e concentrações de ágar.Além disso, como a microcinematografia com lapso de tempo é um processo lento, o uso de oito microscópios baratos ajuda a acelerar a aquisição de dados. Olá, sou Ryan Taylor do laboratório do Dr. Roy Welch do Departamento de Biologia da Universidade de Syracuse. Hoje mostraremos um procedimento para produzir filmes com lapso de tempo de biofilmes bacterianos em nosso laboratório; utilizaremos este procedimento para estudar o comportamento multicelular de biofilmes MTIs.Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, meça a densidade celular de uma cultura de *Occus sanus* de crescimento noturno com um medidor de turbidez, transfira um mililitro da cultura para um tubo de centrífuga de 2,5 mililitros, centrifugue, lave e re-suspenda as bactérias em meio TPM conforme descrito no protocolo escrito anexo, pipete e vortexie para ressuspender completamente o pellet, o que pode levar algum tempo. Em seguida, adicione 0,5 gramas de aros a 50 mililitros de TPM, que é o meio de ensaio.Adicione também 0,5 gramas de aros a 50 mililitros de C-T-T-Y-E, que é o meio nutritivo em disco, e autoclave para esterilizar. Em seguida, mantenha o meio a 55 graus Celsius em uma incubadora ou banho-maria. Enquanto constrói o ensaio de rastreamento.Os complexos de placa prosseguem para construir o disco nutritivo primeiro esterilizador de chama microscópio de vidro. Deslize e coloque uma junta de borracha de silicone estéril com 0,5 milímetro de espessura sobre a lâmina. Pipete cerca de 300 microlitros de meio C TT YE aros no poço formado pela junta na lâmina.O meio de cultura C-T-T-Y-E deve ser montado em chamas, esterilizar outro lâmina e colocá-la em um ângulo sobre os meios de cultura C-T-T-Y-E. Colocar a lâmina em um ângulo evita a formação de bolhas. Uma vez que a lâmina esteja no lugar, prenda o conjunto com clipes pequenos, um em cada lado.Coloque o complexo recortado a quatro graus Celsius e deixe o ágar do meio C-T-T-Y-E solidificar. Isso geralmente leva cerca de cinco minutos. Uma vez que o ágar esteja solidificado, pode-se preparar os complexos de placa utilizados no ensaio de rastreamento.Inicie preparando as lâminas para a construção dos complexos do ensaio. Para cada complexo, flame esterilize duas lâminas de vidro para microscopia. Coloque uma junta de autoclave sobre uma das lâminas para formar a base do ensaio.O outro lâmina é usado para achatamento dos agros e como lâmina de suporte. O topo do ensaio é um lamínula. Primeiro, enrole uma lâmina de microscópio com fita adesiva de identificação, depois esterilize a lamínula de vidro com chama e coloque-a sobre a lâmina envolta previamente esterilizada.Deslize para cima os suportes do porta-objetos para sustentar o lamínula, impedindo que ele quebre. Coloque uma junta de autoclave sobre o lamínula esterilizado por chama com uma pinça. Pressione as juntas na parte inferior do porta-objetos e no lamínula para garantir que formem um selo com o vidro.Caso contrário, os meios dos arranjos podem secar. Reserve as juntas do lâmina e as juntas da lamínula com os lados esterilizados voltados para cima e, a partir daqui, trabalhe apenas em um complexo por vez para evitar que os meios de cultura solidifiquem, o que resultaria em baixa qualidade do filme. Comece colocando o disco nutritivo.Retire o complexo de disco nutritivo de quatro graus Celsius. Remova o bind eclipse e separe previamente as lâminas, expondo os aros de C-T-T-Y-E agora solidificados, utilizando uma pipeta de microamostragem com ponteira descartável de vidro de 100 microlitros. Retire um disco nutritivo de um milímetro de diâmetro do ágar de meio C-T-T-Y-E também e coloque-o no poço criado pela junta na lamínula.Em seguida, retire os ágares de meio TPM do incubador e pipete 300 microlitros para dentro do poço formado pela junta sobre a lamínula e contendo o disco nutritivo. O ágar de meio TPM deve formar um montículo para nivelar o ágar de meio T-P-M-S-A. Coloque uma das lâminas esterilizadas pela chama, sem junta, em um ângulo sobre o ágar de meio TPM. Posicionar a lâmina em um ângulo ajuda a prevenir a formação de bolhas.Prenda o complexo com clipes de papel miniatura, um em cada lado. Coloque o complexo com clipe a quatro graus Celsius e deixe o meio endurecer. Isso geralmente leva cerca de cinco minutos.Uma vez que o meio tenha solidificado, retire o complexo de quatro graus Celsius. Remova os clipes de papel e pressione a extremidade do complexo. Para soltar a lâmina envolvida na fita, remova a lâmina envolvida na fita e coloque-a sobre a bancada para uso posterior.Em seguida, usando um par de pin&ccedil;as como cunha, separe o conjunto de lam&iacute;nula, junta e meio de agarose do l&acirc;mina de suporte e descarte a l&acirc;mina de suporte. N&atilde;o utilize um movimento de alavanca para separar o conjunto de lam&iacute;nula e junta, pois isso poderia resultar na quebra da lam&iacute;nula e/ou na ader&ecirc;ncia do arranjo de meio &agrave; l&acirc;mina de suporte.Após remover a lâmina de suporte, coloque o conjunto de lamínula, junta e meio de cultura sobre a lâmina envolta em fita com o lado da junta voltado para cima. Coloque este conjunto ao lado de um bico de Bunsen para permitir que toda a umidade visível evapore da superfície recém-exposta do meio de cultura em ágar. Não deixe o meio de ágar secar por mais de um minuto.Como isso pode afetar o comportamento coletivo de M Zant, prossiga para semear as células no complexo do ensaio recém-preparado. Assim que a umidade em excesso tiver evaporado do complexo de meio ágar na lamínula, aspire 0,5 microlitros das células concentradas para depositá-las no meio. Ao usar o pipetador, pressione o êmbolo antes de se aproximar do meio ágar.Uma gota de células aparece na ponta da pipeta, facilitando a deposição das células sem que a ponta toque o ágar com meio de cultura. Uma depressão na superfície do ágar pode alterar o comportamento do enxame. Mova a pipeta diretamente para baixo para dispensar as células a aproximadamente um milímetro de distância do disco nutritivo embutido.Em seguida, retire a pipeta diretamente para cima. Dessa forma, garante-se que o grupo seja circular. Após a deposição das células, coloque o complexo ao lado do bico de Bunsen para permitir que a gota de células seque por não mais de 20 segundos.Após a secagem, alinhe o conjunto da junta do lâmina, formando a parte inferior do complexo, com a junta da tampa. Encaixe o meio da junta acrocelular formando a parte superior do complexo. Pressione suavemente para formar um selo.Limpe as superfícies da lâmina e da lamínula com um lenço descartável para remover qualquer resíduo, a fim de evitar condensação. Coloque o conjunto na platina aquecida do microscópio imediatamente após limpar as lâminas, com a lâmina para baixo e a lamínula para cima. Se tiver se formado condensação, deixe o conjunto da lâmina sobre a platina aquecida por alguns segundos antes de iniciar o software de aquisição de imagens.Para preparar o filme, escolha a objetiva apropriada, de 2 x 4 x ou 10 x no microscópio. Ligue a câmera e o microscópio e verifique os níveis de luz para garantir que ela não esteja muito intensa. Ligue o computador e abra o programa de aquisição de imagens.Clique na janela da imagem em tempo real e foque o microscópio. A imagem aparecerá semelhante à mostrada aqui. Inicie a aquisição de imagens.Certifique-se de verificar o foco regularmente durante a primeira hora, pois o ágar do meio tende a sedimentar, causando desvio do foco. Após a conclusão da aquisição de imagens, transfira as imagens adquiridas para armazenamento. Desmonte o conjunto do lâmina mergulhando em etanol 90% durante a noite ou desmonte as vedações para reutilização.Este filme com lapso de tempo mostra em submetidos ao ensaio de rastreamento descrito aqui. A taxa de captura é de uma imagem por minuto com uma ampliação de 20x; a taxa de reprodução é de 60 imagens por segundo. Este filme com lapso de tempo mostra uma população de eant as células em que 1% das células estão expressando GFP.O vídeo foi compilado mesclando imagens alternadas de contraste de fase e fluorescentes. O ensaio foi realizado em C-T-T-Y-E com taxa de captura de 1% Aros, com uma imagem por minuto, com uma ampliação de 100 x. Este filme em lapso de tempo mostra a motilidade deslizante de M Anthes.Este ensaio foi realizado em C-T-T-Y-E com taxa de captura em 1% Aros de uma imagem por minuto com uma ampliação de 100 x. Este filme em lapso de tempo mostra a motilidade por contorção de P OSA. Este ensaio foi realizado em LB com taxa de captura em 1% Aros de uma imagem por minuto.Com uma ampliação de 20x, a taxa de reprodução é de 60 imagens por segundo. Este filme em lapso de tempo mostra a motilidade coletiva de Smar. Este ensaio foi realizado em LB e 1% de Aris, com uma taxa de captura de uma imagem por minuto.Com uma ampliação de 20x, a taxa de reprodução é de 60 imagens por segundo. Este filme com lapso de tempo mostra a motilidade deslizante de EGT. Este ensaio foi realizado em LB com 0,5% de Tag; a taxa de captura é de uma imagem por minuto, enquanto a ampliação de 20x resulta em uma taxa de reprodução de 120 imagens por segundo devido à fragilidade do meio com 0,5% de arose em lv.Este ensaio emprega o uso das juntas maiores observadas na figura um B. Acabamos de mostrar como gerar filmes com lapso de tempo de biofilmes bacterianos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter calma e ser o mais preciso possível para obter resultados consistentes.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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