Comportamento de gravação em multicelulares Myxococcus xanthus Os biofilmes usando lapso de tempo Microcinematography

O objetivo geral do experimento a seguir é desenvolver um ensaio cinematográfico de micros de lapso de tempo barato com rigor suficiente para gerar resultados reprodutíveis e quantificáveis. Isso é conseguido empregando o uso de juntas de silicone reutilizáveis de baixo custo para construir placas de meio de agros ou lâminas de microscópio. São obtidos resultados que mostram que esses complexos de placas permanecem hidratados e suficientemente oxigenados por mais de uma semana em uma variedade de tipos de meios e concentrações de ágar.

Além disso, como a microcinematografia com lapso de tempo é um processo lento, o uso de oito microscópios baratos ajuda a acelerar a aquisição de dados. Olá, sou Ryan Taylor, do laboratório do Dr. Roy Welch, do Departamento de Biologia da Universidade de Syracuse. Hoje mostraremos um procedimento para fazer filmes de lapso de tempo de biofilmes bacterianos em nosso laboratório, usaremos esse procedimento para estudar o comportamento multicelular dos biofilmes de MTIs.

Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, meça a densidade celular de uma cultura de Occus sanus durante a noite com um medidor de clut, transfira um mililitro da cultura para uma lavagem de pellets de tubo de centrífuga de 2,5 mililitros e ressuspenda as bactérias em meio TPM conforme descrito no protocolo escrito que acompanha, pipeta e vórtice para ressuspender completamente o pellet, o que pode demorar um pouco. Em seguida, adicione 0,5 gramas de aros a 50 mililitros de TPM, que é o meio de ensaio.

Adicione também 0,5 gramas de aros a 50 mililitros de C-T-T-Y-E, que é a autoclave de mídia de disco nutritivo para esterilizar. Em seguida, mantenha o meio a 55 graus Celsius em uma incubadora ou banho-maria. Durante a construção do ensaio de rastreamento.

Os complexos de placas prosseguem para construir o primeiro microscópio de vidro esterilizador de chama do disco nutritivo. Deslize e coloque uma junta de borracha de silicone estéril de 0.5 milímetro de espessura em cima da lâmina. Pipetas em torno de 300 microlitros de meio C TT YE aros no poço criado pela junta na lâmina.

O meio agro C-T-T-Y-E deve amontoar chamas, esterilizar outra lâmina e colocá-la em um ângulo em cima do aros de mídia C-T-T-Y-E. Colocar o slide para baixo em um ângulo evita a formação de bolhas. Assim que o slide estiver no lugar, preencha o complexo com mini clipes de fichário, um de cada lado.

Coloque o complexo cortado a quatro graus Celsius e deixe o meio C-T-T-Y-E agro endurecer. Isso geralmente leva cerca de cinco minutos. Uma vez que o agro é definido, pode-se preparar os complexos de placas usados no ensaio de rastreamento.

Comece preparando as lâminas para a construção dos complexos de ensaio. Para cada chama complexa esterilizou duas lâminas de microscópio de vidro. Coloque uma junta de autoclave em cima de uma das lâminas para formar a parte inferior do ensaio.

A outra corrediça é usada para achatar os agros e como corrediça de suporte. A parte superior do ensaio é uma lamínula. Primeiro enrole uma lâmina de microscópio com fita adesiva, depois a lamínula de vidro do esterilizador de chama e coloque-a em cima da lâmina embrulhada esterilizada.

Deslize para cima o slide enrolado suporta a lamínula, evitando que ela rache. Coloque uma junta de autoclave em cima da lamínula esterilizada por chama com uma pinça. Pressione as juntas na corrediça inferior e na lamínula para garantir que formem uma vedação com o vidro.

Caso contrário, a mídia a arrays pode secar. Coloque a junta deslizante e os conjuntos de juntas de lamínula de lado com os lados esterilizados para cima daqui para trabalhar apenas em um complexo de cada vez para evitar que os meios se solidifiquem, o que resultaria em baixa qualidade do filme. Comece colocando o disco nutritivo.

Remova o complexo nutritivo do disco de quatro graus Celsius. Remova o eclipse de ligação e a parte anterior das lâminas expondo o aros CTYE agora solidificado usando uma pipeta de micro amostragem com uma ponta descartável de vidro de 100 microlitros. Remova também um disco nutritivo de um milímetro de diâmetro do meio agro C-T-T-Y-E e coloque-o no poço criado pela junta na lamínula.

Em seguida, recupere o meio TPM agros da incubadora e pipete 300 microlitros no poço criado pela junta na lamínula e contendo o disco nutritivo. A mídia TPM Agros deve ser montada para achatar o aros médio TPMS Coloque uma das lâminas esterilizadas por chama sem junta em um ângulo na parte superior da mídia TPM aros. Colocar o slide em um ângulo ajuda a evitar a formação de bolhas.

Prenda o complexo com mini clipes de fichário, um de cada lado. Coloque o complexo recortado a quatro graus Celsius e deixe o meio surgido endurecer. Isso geralmente leva cerca de cinco minutos.

Uma vez que a mídia tenha se estabelecido, remova o complexo de quatro graus Celsius. Remova os clipes de fichário e aperte a extremidade do complexo. Para soltar a corrediça enrolada em fita, remova a corrediça enrolada em fita e coloque-a na bancada para uso posterior.

Em seguida, usando um par de pinças como cunha. Separe o complexo agros da junta da lamínula da corrediça de suporte e descarte a corrediça de suporte. Não use um movimento de intromissão para separar o complexo da junta da lamínula, pois isso pode resultar na frenagem da lamínula e/ou na aderência do raio da mídia à corrediça de suporte.

Depois de remover a corrediça de suporte, coloque o complexo de mídia da junta da lamínula na corrediça enrolada em fita com o lado da gaxeta para cima. Coloque este complexo próximo a um queimador para permitir que toda a umidade visível evapore da superfície recém-exposta do meio agros. Não deixe o meio secar por mais de um minuto.

Como isso pode afetar o comportamento do enxame de M Zant, prossiga para a placa das células no complexo de ensaio recém-preparado. Uma vez que o excesso de umidade tenha evaporado da lamínula da mídia agros complex, aspire 0,5 microlitros das células concentradas para depositar na mídia. Aeros pressionam a ponta da pipeta antes de se aproximar dos meios agros.

Uma gota de células aparece na parte inferior da ponta da pipeta, facilitando o depósito das células sem que a ponta toque no meio agros. Uma depressão na superfície dos agros pode alterar o comportamento do enxame. Mova a pipeta diretamente para baixo para dispensar as células a aproximadamente um milímetro de distância do disco nutritivo incorporado.

Em seguida, puxe a pipeta de volta para cima. Desta forma, garante-se que o enxame seja circular. Uma vez que as células são depositadas, coloque o complexo próximo ao queimador para permitir que as células sequem por não mais de 20 segundos.

Após a secagem, alinhe o conjunto da junta deslizante que forma a parte inferior do complexo com a junta da tampa. Junta deslizante meio acro complexo de células formando o topo do complexo. Pressione suavemente para formar uma vedação.

Limpe as superfícies da corrediça na lamínula com um pano de limpeza para remover qualquer resíduo e evitar condensação. Coloque o complexo no microscópio aquecido stage imediatamente após limpar as lâminas com a lâmina para baixo e a lama de cobertura para cima. Se houver formação de condensação, deixe o complexo de lâminas descansar no aquecido stage por vários segundos antes de iniciar o software de aquisição de imagem.

Para preparar o filme, escolha a objetiva apropriada, dois x quatro x ou 10 x no microscópio. Ligue a câmera e o microscópio e verifique os níveis de luz para garantir que a luz não seja muito intensa. Inicie o computador e abra o programa de aquisição de imagens.

Clique na janela de imagem ao vivo e foque o microscópio. A imagem é semelhante à mostrada aqui. Comece a adquirir imagens.

Certifique-se de verificar o foco regularmente durante a primeira hora, pois o ágar mídia tende a assentar, fazendo com que o foco se desvie. Quando a aquisição da imagem estiver concluída, transfira as imagens adquiridas para armazenamento. Quebre o complexo de lâminas embebendo em etanol a 90% durante a noite ou TOLA as juntas para reutilização.

Este filme de lapso de tempo os mostra submetidos ao ensaio de rastreamento descrito aqui. A taxa de captura é de uma imagem por minuto com uma ampliação de 20 x a taxa de reprodução é de 60 imagens por segundo. Este filme de lapso de tempo mostra uma população de células onde 1% das células estão expressando GFP.

O filme foi compilado pela fusão de contraste de fase alternada e imagens fluorescentes. O ensaio foi realizado em C-T-T-Y-E em 1%A taxa de captura de Aros é de uma imagem por minuto com uma ampliação de 100 x. Este filme de lapso de tempo mostra a motilidade deslizante de M Anthes.

Este ensaio foi realizado em C-T-T-Y-E em 1%A taxa de captura de Aros é uma imagem por minuto com uma ampliação de 100 x. Este filme TimeLapse mostra P OSA se contraindo motilidade. Este ensaio foi realizado em LB em 1% A taxa de captura de Aros é de uma imagem por minuto.

Com uma ampliação de 20 x, a taxa de reprodução é de 60 imagens por segundo. Este filme de lapso de tempo mostra que Smar sente a motilidade do enxame. Este ensaio foi realizado em LB e a taxa de captura de 1% Aris é de uma imagem por minuto.

Com uma ampliação de 20 x, a taxa de reprodução é de 60 imagens por segundo. Este filme de lapso de tempo mostra a motilidade deslizante EGT. Este ensaio foi realizado em LB em 0,5% A taxa de captura de rosa é de uma imagem por minuto, pois uma ampliação de 20 x a taxa de reprodução é de 120 imagens por segundo devido à fragilidade de 0,5% surgiu em lv.

Este ensaio emprega o uso das juntas maiores vistas na figura um B. Acabamos de mostrar como gerar filmes de lapso de tempo de biofilmes bacterianos. Ao fazer este procedimento. É importante lembrar de levar o seu tempo e ser o mais preciso possível para obter resultados consistentes.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.