Name: Método para o isolamento de Francisella tularensis Membranas externas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-29T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprenda a isolar vesículas de membrana externa de Francisella tularensis por lise osmótica e ultracentrifugação em gradiente de sacarose. Este método permite estudar proteínas de membrana e patogenicidade bacteriana.

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O projeto descrito foi apoiada pelo Grant Numbers P01 AI055637 e U54 AI057156 de NIAID / NIH. Seu conteúdo são da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial dos Programas de RCE Office, NIAID, ou NIH.

Dia 1: F. tularensis inoculação placa <ol><li> Culturas prato congelado estoque de F. tularensis em Mueller-Hinton suplementado com 2,5% (vol / vol) de doadores soro bovino, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, 0,1% (wt / vol), glicose e 0,025% (wt / vol) pirofosfato de ferro. Crescer F. tularensis a 37 ° C com 5% de CO 2 por aproximadamente 24 h. </li></ol> Dia 2: F. líquido tularensis inoculação media <ol><li> Preparar e autoclave 1 litro de meio-cação ajustada Mueller-Hinton (contendo 1,23 mM cloreto de cálcio dihidratado e 1,03 mM de cloreto de magnésio hexa-hidratado). Quando resfriado a 37 ° C, médio complementar ainda mais com glicose a 0,1% (wt / vol), pirofosfato de ferro de 0,025% (wt / vol), e 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Filtro de esterilizar (0,22 μ) médio em duas alíquotas de 500 ml. </li><li> Retire 12 ml de meio suplementado Mueller-Hinton e transferir para um tubo estéril Falcon de 50 ml. </li><li> Usando um loop de inoculação estéril de 10 mL, raspar uma loopful grande de F. tularensis crescimento de placas de ágar (a partir de dia 1) e bactérias transferência em 12 ml de Mueller-Hinton médio (ver Etapa 2). Vezes solução pipeta múltiplos break-up aglomerações e preparar suspensão bacteriana homogênea. Não vortex. </li><li> Usando uma pipeta estéril, inocular cada navio de 500 ml com 5 ml de suspensão bacteriana a partir da Etapa 3. Crescer culturas caldo a 37 ° C por 14 a 18 h com agitação suave (190-200 rpm em um New Brunswick Innova série 2300 shaker). </li></ol> Dia 3: lise, Spheroplasting osmótica, sacarose e centrifugação em gradiente de densidade <ol><li> Obter F. culturas tularensis da incubadora agitação e retire uma alíquota de 1 ml de cada cultura de 500 ml para verificar as densidades ópticas respectivos. Nós descobrimos que a extração de membrana ideal e resultados de isolamento quando se utiliza F. tularensis células em fase logarítmica iniciais de crescimento, que se correlaciona com uma OD 600 entre 0,2-0,4 (~ 10 julho - 10 agosto UFC / ml). Culturas com uma 600 OD inferior a 0,2 não renderá quantidade suficiente de material da membrana total para gradientes de sacarose subseqüentes. Por outro lado, culturas com uma 600 OD superior a 0,4 (se aproximando da fase estacionária) foram encontrados para o rendimento misto membrana fusões. </li><li> Centrífuga culturas em 7.500 x g por 30 min a 15 ° C para coletar as células. Recomendamos a centrifugação das culturas em quatro garrafas de 250 ml de centrífuga, porque facilita suspensão pellet subseqüentes. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante de mídia de cada frasco de centrífuga e bata as garrafas em papel absorvente para remover excesso de meio de crescimento. </li><li> Dentro de 10 min após a conclusão de centrifugação, suspender cada pellet bacteriano em 8,75 ml de sacarose 0,75 M (em 5 mM Tris, pH 7,5). Todos os quatro pellets bacteriana deve ser suspenso e transferido (35 total de ml de suspensão bacteriana) para um balão de 250 ml estéril (com uma pequena stirbar) dentro de 10 min. </li><li> Enquanto suavemente a mistura da suspensão de células em um stirplate, lentamente, adicione 70 ml (2 volumes), de 10 mM EDTA dissódico (em 5 mM Tris, pH 7.8) ao longo de 10 min. Adicionar a solução de EDTA com a ponta da pipeta abaixo do nível de suspensão de células para evitar elevadas concentrações locais de EDTA. O stirbar deve ser girando a uma taxa suficiente para misturar a suspensão da célula, mas não rápido o suficiente para causar espuma ou formação de bolhas. Após a solução de EDTA foi adicionado, incubar a solução por 30 min em temperatura ambiente. </li><li> Após a incubação de 30 minutos, lentamente, adicione 11 ml (1 / 10 º volume) de uma solução de lisozima 2 mg / ml a uma concentração final de 200 mg / ml. Continue a misturar a suspensão de células durante a adição de solução de lisozima. Como observado acima, adicionar a solução de lisozima com a ponta da pipeta abaixo do nível de fluido celular suspensão para evitar concentrações elevadas de locais de lisozima. Ações lisozima soluções (2 mg / ml) podem ser preparados em single-use alíquotas e armazenadas a -20 ° C durante três a quatro meses. Incubar a solução resultante por 30 min em temperatura ambiente. </li><li> Durante a incubação de 30 minutos, prepare um frasco estéril 1L com um pequeno stirbar e 530 ml de temperatura ambiente Cellgro Molecular Grade dH 2 O (4,5 volumes). </li><li> Lisar osmoticamente suspensão de células (a partir da Etapa 6) por diluição lenta (caudal de aproximadamente 11 ml / min) em 530 ml de dH Molecular Grade 2 O (a partir da Etapa 7) ao longo de 10 a 15 min com a mistura suave. Por causa do maior volume de solução nessa etapa, aumentar a velocidade stirbar para assegurar a mistura adequada. O stirbar deve ser girando a uma taxa suficiente para dispersar completamente a suspensão de células, uma vez adicionado ao 2 dH O, mas não rápido o suficiente para levar à formação de espuma ou formação de bolhas. Adicione a suspensão de células com a ponta da pipeta descansando no fundo do frasco, ao lado do stirbar, para facilitar a diluição uniforme do cell de suspensão. Descobrimos que 25 ml-pipetas melhor trabalho durante esta etapa. Acompanhar atentamente o processo de diluição e interromper o fluxo necessário para dispersar acumulações locais de células, aglomerados de células, e tufos de células. Incubar a solução resultante por 30 min em temperatura ambiente. Note que este passo parece ser um dos mais desafiadores e críticos para o sucesso geral do experimento. </li><li> Após a incubação de 30 min, a transferência de 40 alíquotas ml da solução de lise osmótica em 50 ml tubos cônicos e centrifugar a 7500 xg por 30 min a 10 ° C para remover as células intactas e detritos. </li><li> Após a centrifugação, remover cuidadosamente 27-30 ml do sobrenadante de cada tubo cônico e sobrenadantes piscina em um frasco estéril 1L </li><li> Transferir 25 ml do sobrenadante em pool, cada, em 16 tubos de ultracentrífuga e centrifugar a 200.000 x g (44.400 rpm em rotor F50L-8x39 ultracentrífuga FiberLite) por 2 horas a 4 ° C. Note que cada rotor detém 8 tubos, de modo que este passo requer dois rotores e duas ultracentrífugas. Alternativamente, o segundo conjunto de 8 tubos devem ser mantidos a 4 ° C até centrifugado. </li><li> Dentro de 10 min do fim do percurso de ultracentrífuga, prepare modificada tampão de ressuspensão de membrana. Transferência de 8 ml de tampão de suspensão de membrana (25% [wt / wt] sacarose, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2) para um tubo estéril e adicionar 1 comprimido de EDTA-free cocktail inibidor da protease e 375 U de Benzonase. Delicadamente misturar a solução para dissolver comprimido inibidor da protease. </li><li> Após ultracentrifugação, cuidadosamente despeje sobrenadantes, inverter os tubos ultracentrífuga em material absorvente, e bata tubos para remover excesso de sobrenadante. Marca a localização de cada pellet de membrana com um marcador para ajudar na visualização. Delicadamente ressuspender oito pellets de membrana com 600 mL cada um tampão modificado membrana ressuspensão. Transferir cada ressuspensão de membrana para o próximo conjunto de oito tubos, delicadamente ressuspender estes oito pellets, eo pool de resuspensions membrana, resultando em um tubo estéril. As membranas são difíceis peletizada para voltar a suspender, por isso continuar passando o buffer ressuspensão modificado membrana sobre a pelota até que as cascas de distância da parede do tubo. Muitas vezes é necessário usar a ponta micropipeta para raspar o pellet membrana fora da parede do tubo e ajuda no processo de ressuspensão. Quando pipetagem, evitar formação de espuma ou formação de bolhas. Note que este passo parece ser um dos mais desafiadores e críticos para o sucesso geral do experimento. </li><li> Quando a membrana de pellets foram ressuspendidos e removidos todos os 16 tubos, lavar todos os quatro tubos com 600 mL de tampão modificado membrana ressuspensão. A lavagem deve ser centrada em torno da área marcada (membrana pellet) de cada tubo. Transferência da lavagem para o tubo de ressuspensão de membrana. Repita a etapa de lavagem para os restantes três conjuntos de quatro tubos. </li><li> Incubar a membrana com a ressuspensão de balanço suave durante 30 min à temperatura ambiente para se degradar DNA e ajuda na redução de material floculantes. </li><li> Remover uma pequena alíquota da suspensão de membrana e realizar a quantificação de proteína de membrana para determinação do rendimento total. Normalmente, preparar puro, 1:1, diluída (em 2,5% SDS), e 1:3 diluído (em 2,5% SDS) amostras de membrana, o calor as amostras a 90 ° C por 10 min, e usar o ensaio de proteína BioRad DC para quantificar a concentração de proteína de membrana ressuspensão. Produção de proteína total é, geralmente, entre 1,0 mg / ml e 1,6 mg / ml. O uso de calor e SDS são obrigados a liberar OMPs das membranas extraídas de forma que um valor de quantificação mais precisa da proteína pode ser obtida. </li><li> Prepare gradientes de sacarose linear por camadas 1,8 ml cada uma das soluções de sacarose (wt / wt, preparado em 5 mM EDTA, pH 7,5) em 14 x 95 mm tubos de Ultra-Clear ultracentrífuga na seguinte ordem: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Camadas de gradientes de sacarose é mais fácil de realizar quando se utiliza um bulbo de pipetador, não uma pipeta automática. </li><li> Com base na quantificação de proteínas da membrana ressuspensão (Passo 16), a camada de 1,5 mg de ressuspensão de membrana no topo de cada gradiente. A cada 14 x 95 milímetros tubo de ultracentrífuga tem uma capacidade máxima de 12,5 ml e, dado que 10,8 ml é contabilizado pelas soluções de sacarose a partir do Passo 17, você não deve carregar mais de 1,7 ml de ressuspensão de membrana por gradiente. Individualmente e pesar cuidadosamente ajustar o peso final de cada tubo gradiente de sacarose (adicionando ou removendo a ressuspensão de membrana), para que todos os tubos o mesmo peso (± 0,01 g). </li><li> Transferência de gradientes de sacarose em um balde de rotor SW-40Ti balançando e centrifugar a 256.000 x g (38.000 rpm) por um período mínimo de 17 horas a 4 ° C. </li></ol> Dia 4: Coleta de frações gradiente de sacarose <ol><li> Após 17 h de centrifugação, parar o processo de centrifugação, e remova cuidadosamente gradientes de sacarose a partir do rotor SW-40Ti. </li><li> Limpar cuidadosamente o fundo do tubo de gradiente de sacarose com etanol 70%, perfurar afundo do tubo com uma agulha de 21G, e recolher seqüencial 500 mL frações do gradiente em tubos de microcentrífuga estéril. Repita o procedimento para gradientes subseqüentes. O gradiente deve ser a escorrer por fluxo de gravidade, de modo a não perturbar o gradiente de sacarose. No entanto, se o gotejamento cessa a partir do fundo do tubo de gradiente, uma pequena quantidade de pressão pode ser aplicada ao topo do tubo com o dedo. </li><li> Determinar o índice de refração de cada fração gradiente de sacarose utilizando um refratômetro e correlacionar o índice de refração com uma densidade específica em g / ml 1. Avaliar a localização de proteínas através da preparação de frações de sacarose representante gradiente (incrementos de densidade de 0,01; de 1,11 g / ml a 1,26 g / ml) para SDS-PAGE de separação, a transferência para nitrocelulose, e immunoblotting. </li></ol> Resultados representante Quando realizada corretamente, este procedimento resulta na separação completa de IM e vesículas OM de ambos Tipo A Tipo (por exemplo, SchuS4) e B (por exemplo, LVS) das cepas de F. tularensis. Como mostrado na Immunoblots representante na Figura 1, F. OMPs tularensis localizar entre as densidades de 1,17 e 1,20 g / ml. Em comparação, PIM localizar entre as densidades de 1,13 e 1,14 g / ml. <img src="/files/ftp_upload/2044/2044fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Immunoblotting de F. tularensis gradientes de densidade de sacarose. Frações seqüenciais foram coletados a partir de gradientes e densidades (g / ml) foram calculados com base em índices de refração. Proteínas foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para nitrocelulose, e immunoblotted para detectar OMP e fracionamento IMP. mw, prestained padrões de peso molecular, com tamanhos (em kDa) observou, no lado esquerdo de cada blot. LVS, toda lisados ​​celulares de F. LVS tularensis. O correspondente fração sacarose densidades de gradiente são anotados acima de suas respectivas faixas. OMPs e PIM, como observado na margem esquerda, foram detectadas com anti-soros, policlonal monoespecífico. Resultados semelhantes foram obtidos para F. tularensis SchuS4.

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<li>Twine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Francisella+tularensis+proteome%3A+low+levels+of+ASB-14+facilitate+the+visualization+of+membrane+proteins+in+total+protein+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts.</a> J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo descreve uma variação da lise, spheroplasting osmótica, sacarose e gradiente de densidade centrifugação &quot;padrão ouro&quot; para a separação física e enriquecimento de bactérias Gram-negativas OMs bacteriana de outros componentes celulares 2, 3, 4. Considerando que anteriormente descrita a aplicação deste método para isolar OMs de ambos os tipos A e B Tipo de cepas de F. tularensis 5, esta apresentação oferece um procedimento mais detalhado e otimizado para o isolamento do OM. Na verdade, este é um avanço importante para a identificação de potenciais de superfície exposta e fatores de virulência deste patógeno presuntivo mortal. A importância deste procedimento foi demonstrada em estudos realizados por nosso laboratório mostram que a imunização de camundongos com OMPs purificada de uma protecção substancial contra virulenta Tipo A F. tularensis desafio pulmonar 6. Como observado acima fase de crescimento, das células bacterianas, monitoramento cuidadoso durante a lise osmótica, gentil e ressuspensão de pellets de membrana são passos críticos que parecem estar relacionados com o sucesso / fracasso deste processo de separação de membrana. Enquanto este método otimizado é rigoroso e sujeito a alguma variabilidade experimental, a OMs resultando parecem ser de qualidade notavelmente melhorada em comparação com aqueles obtida a partir do uso de detergentes, cloreto de lítio, carbonato de sódio ou 7, 8, 9, 10, 11, 12.

<table><tbody><tr><td>Soro de bezerro doador</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>IsoVitaleX</td><td>BD Biosciences</td><td>211876</td><td></td></tr><tr><td>Água dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O grau molecular Cellgro</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de policarbonato de 38,5 ml</td><td>FiberLite</td><td>010-0514</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ultracentrífuga F50L-8x39</td><td>FiberLite</td><td>096-087051</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel completo de inibidores de protease sem EDTA</td><td>Roche Group</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de proteína DC</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga Ultra-Clear 14x95 mm</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>344060</td><td></td></tr><tr><td>Rotor oscilante SW-40Ti</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Refratômetro de bancada Abbe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-964-10</td><td></td></tr></tbody></table>

método para o isolamento de francisella tularensis membranas externas

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Francisella tularensis é um cocobacilo Gram-negativos intracelulares eo agente causador da tularemia zoonose. Quando comparado com outros patógenos bacterianos, a dose infecciosa extremamente baixa (&lt;10 UFC), progressão rápida da doença, e alta morbidade e mortalidade sugerem que as cepas virulentas de Francisella codificam para fatores de virulência da novela. Superfície exposta moléculas, proteínas da membrana externa ou seja (OMPs), foram mostrados para promover a célula hospedeira bacteriana de ligação, de entrada, a sobrevivência intracelular, virulência e evasão imune. A relevância para o estudo de OMPs é ainda mais enfatizada pelo fato de que eles podem servir como vacinas de proteção contra uma série de doenças bacterianas. Considerando OMPs pode ser extraído de bactérias gram-negativas através de técnicas de extração em massa de membrana, incluindo sonicação de células seguida de centrifugação e / ou extração de detergente, estas preparações são freqüentemente contaminados com periplasmic e / ou citoplasmática (interna) de membrana (IM) contaminantes. Durante anos, o &quot;padrão ouro&quot; método para a separação bioquímicos e biofísicos de bactérias gram-negativas IM e membranas externas (OM) tem sido a de bactérias sujeitas à lise osmótica e spheroplasting, seguido por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose. Uma vez mergulhado em um gradiente de sacarose, OM pode ser separado de mensagens instantâneas com base nas diferenças em densidade de flutuação, acredita-se ser baseada em grande parte, a presença de lipopolissacarídeo (LPS) na OM. Aqui, descrevemos um método rigoroso e otimizados para extrair, enriquecer, e isolar F. tularensis membranas externas e seus associados OMPs.

Um protocolo para a separação de membranas internas e externas da<em&gt; Francisella tularensis</em&gt; Por lise, spheroplasting osmótica, sacarose e ultracentrifugação em gradiente de densidade.

Método para o isolamento de Francisella tularensis Membranas externas

Francisella tularensis é um cocobacilo intracelular Gram-negativo e o agente causador da tularemia, uma doença zoonótica. Quando comparada com outras...

O isolamento de vesículas da membrana externa de Francisella e das proteínas associadas à membrana externa inicia-se com a lise osmótica de células bacterianas. Bactérias na fase logarítmica são tratadas sequencialmente com soluções hipertônicas de sacarose, EDTA e lisozima antes de serem diluídas lentamente em água desionizada. Os lisados bacterianos resultantes são submetidos a uma centrifugação de baixa velocidade, que remove detritos celulares e células não rompidas, seguida por uma centrifugação de alta velocidade para o pellet de vesículas da membrana. Em seguida, vesículas de membrana total são sobrepostas em gradientes de densidade de sacarose para separar vesículas da membrana interna ou MI e da membrana externa ou ME. As vesículas da ME podem ser separadas das vesículas da MI com base em diferenças nas densidades de flutuação, que acredita-se dependerem principalmente da presença de lipopolissacarídeo ou LPS na ME. A imunodetecção de frações sequenciais provenientes de gradientes de densidade de sacarose mostra separação espacial de proteínas da membrana interna de proteínas da membrana externa. Olá, sou o Dr. Michael Norgaard, e este é o Dr. Jason Huntley do Departamento de Microbiologia do Centro Médico UT Southwestern em Dallas.Hoje, o Dr. Huntley mostrará um procedimento para extrair, enriquecer e isolar as membranas externas de células de France e suas proteínas de membrana associadas. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar moléculas localizadas na membrana externa e potencialmente expostas na superfície deste patógeno bacteriano intracelular. Temos um dia agitado, então vamos começar.Para iniciar este procedimento, prepare e cultive dois cultivos de 500 mililitros de bactérias FCIs conforme descrito no protocolo escrito acompanhante. Retire os cultivos bacterianos do incubador agitador e remova um mililitro de Eloqua de cada cultura para medição de OD, a fim de obter células na fase logarítmica inicial de crescimento, o que corresponde a uma OD 600 entre 0,2 e 0,4. Os resultados ideais de extração e isolamento de membrana são obtidos quando os cultivos atingem a OD 600 desejada.Utilize quatro frascos de centrífuga de 250 mililitros para centrifugar os cultivos a 7.500 ×g por 30 minutos a 15 °C, com o objetivo de coletar as células. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante do meio de cada frasco de centrífuga e bata firmemente os frascos em material absorvente para remover o excesso de meio de crescimento. Dentro de 10 minutos após a conclusão da centrifugação, suspenda cada pellet bacteriano em 8,75 mililitros de sacarose 0,75 molar em triss 5 milimolar pH 7,5.Após a suspensão de cada pellet, transfira a solução para um frasco estéril de 250 mililitros, contendo um pequeno bastão de agitação. Repita para os quatro pellets bacterianos, obtendo uma suspensão final de pellets bacterianos com volume total de 35 mililitros. Misture bem a suspensão celular em uma placa agitadora, mas não muito rapidamente.Para evitar espuma ou bolhas durante a mistura lenta, adicione 70 mililitros da solução de EDTA 10 milimolar à suspensão ao longo de 10 minutos. Mantenha a ponta da pipeta abaixo do nível da suspensão celular para evitar concentrações locais elevadas de EDTA. Após a adição do EDTA, incube a solução por 30 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, enquanto ainda se mistura lentamente, adicione 11 mililitros de uma solução de lisozima a dois miligramas por mililitro para obter uma concentração final de 200 microgramas por mililitro. Continue misturando a suspensão celular durante a adição da solução de lisozima. Como antes, mantenha a ponteira abaixo do nível da suspensão celular.Incube as células com a lisozima por 30 minutos à temperatura ambiente. Durante esta incubação, prepare um frasco estéril de um litro com um pequeno agitador magnético e 530 mililitros de água desionizada molecular grade à temperatura ambiente.Quando as células terminarem a incubação, lise osmoticamente a suspensão celular usando uma pipeta de 25 mililitros, apoiada no fundo do frasco ao lado da barra magnética, diluindo lentamente as células na água do frasco de um litro ao longo de 10 a 15 minutos, com mistura suave. Este passo é delicado e essencial para o sucesso geral do experimento. A agitação deve ser rápida o suficiente para dispersar completamente a suspensão celular, mas não excessivamente rápida, a fim de evitar a formação de espuma ou bolhas, conforme necessário.Aumente lentamente a velocidade da barra de agitação para garantir uma mistura adequada. Monitore cuidadosamente o processo de diluição e ajuste a taxa de fluxo ou rotacione o frasco conforme necessário para dispersar acúmulos locais de células, agregados celulares e flocos celulares. Após a adição de todas as células, incube a mistura por 30 minutos à temperatura ambiente. Ao final da incubação, transfira alíquotas de 40 mililitros da solução de lise osmótica para tubos cónicos de 50 mililitros e centrifugue a 7.500 Gs por 30 minutos a 10 graus Celsius.Para remover células intactas e detritos após a centrifugação, retire cuidadosamente de 27 a 30 mililitros de sobrenadante de cada tubo cônico e reúna o sobrenadante em um frasco estéril de um litro. Transfira 25 mililitros do sobrenadante coletado para cada um dos 16 tubos de ultracentrífuga e centrifugue a 200.000 Gs por duas horas a quatro graus Celsius. Dez minutos antes de a centrifugação ser concluída.Prepare o tampão de suspensão da membrana modificado. Combine oito mililitros de tampão de suspensão da membrana com um comprimido de coquetel de inibidores de protease sem EDTA e 375 unidades de benzonase em um tubo estéril e misture suavemente após a centrifugação das células lisadas. Prossiga para recuperar o pellet de membrana.Quando a ultracentrifugação das células lisadas estiver concluída, despeje cuidadosamente o sobrenadante, em seguida, inverta os tubos sobre material absorvente e bata-os firmemente. Para remover o sobrenadante em excesso, marque a localização de cada pellet de membrana com uma caneta para facilitar a visualização. Resuspenda suavemente oito pellets de membrana com 600 microlitros de tampão de ressuspendimento de membrana modificado cada um.É difícil ressuspender os pellets de membrana. Portanto, continue passando suavemente o sobrenadante modificado do tampão de ressuspensão da membrana sobre o pellet até que ele se desprenda da parede do tubo. Este é outro passo desafiador e crítico para o sucesso geral do experimento.Se necessário, use a ponta de pipeta micrométrica para desprender o pellet de membrana da parede do tubo. Ao pipetar, evite formação de espuma ou bolhas, pois forças de cisalhamento excessivas levarão à formação de micelas mistas, o que impede a separação da membrana. Transfira cada suspensão reconstituída de membrana para o próximo conjunto de oito tubos.Resuspenda suavemente os pellets restantes e reúna todas as suspensões em um tubo estéril. Após remover os pellets de membrana de todos os 16 tubos, lave cada grupo de quatro tubos com 600 microlitros de tampão modificado de ressuspensão de membrana. Concentre a lavagem na área marcada de cada tubo e combine a lavagem com as membranas ressuspensas.Repita a lavagem para os tubos restantes. Incube a suspensão de membrana com agitação suave durante 30 minutos à temperatura ambiente para degradar o DNA e auxiliar na redução do material floculento. Em seguida, retire uma pequena alíquota da suspensão de membrana e realize a quantificação de proteína.Para determinar o rendimento total de membrana, prepare diluições de um para um e de um para três da suspensão de membrana em SDS a 2,5% aquecido, e as suspensões de membrana não diluídas de um para um e de um para três a 90 graus Celsius por 10 minutos. O SDS e o calor são necessários para liberar O MPS das membranas extraídas. Utilize o ensaio de proteína BioRad DC para quantificar a concentração de proteína na ressuspensão da membrana.O rendimento total de proteína geralmente está entre um e 1,6 miligramas por mililitro. Uma vez determinada a concentração de proteína na preparação de membrana, as amostras podem ser separadas em um gradiente de sacarose. Comece preparando uma série de soluções de sacarose em EDTA.Para preparar os gradientes lineares de sacarose, utilize uma pipeta com bulbo para sobrepor 1,8 mililitro de cada solução de sacarose em tubos ultracentrífugos UltraClear de 14 por 95 milímetros, na seguinte ordem: 55%, 50%, 45%, 40%, 35% e 30%. Em seguida, sobreponha 1,5 miligrama de suspensão de membrana resus sobre cada gradiente. Não carregue mais de 1,7 mililitro de suspensão de membrana resus por gradiente; pese individualmente cada tubo e ajuste cuidadosamente o peso final adicionando ou removendo suspensão de membrana, de modo que todos os tubos tenham o mesmo peso. Transfira os gradientes de sacarose para um rotor oscilante SW 40 TI e centrifugue a 256.000 ×g por um mínimo de 17 horas a quatro graus Celsius.Após 17 horas de centrifugação, interrompa a corrida da centrífuga e remova cuidadosamente os gradientes de sacarose do rotor. Em seguida, colete as frações. Limpe cuidadosamente a parte inferior do tubo de gradiente de sacarose com etanol a 70%.Em seguida, perfure a parte inferior do tubo com a agulha de 21 graus e colete frações sequenciais de 500 microlitros do gradiente em tubos estéreis para microcentrífuga. O gradiente deve escorrer por fluxo gravitacional para não perturbar o gradiente de sacarose. No entanto, se a gotejamento cessar na parte inferior do tubo do gradiente, pode-se aplicar uma pequena pressão na parte superior do tubo usando o dedo.Por fim, determine o índice de refração de cada fração do gradiente de sacarose utilizando um refratômetro, correlacionando o índice de refração com uma densidade específica em gramas por mililitro. Avalie a localização proteica de frações representativas do gradiente de sacarose por meio de separação em gel de SDS-PAGE e transferência imunológica. Abaixo, tem-se uma transferência imunológica de frações do gradiente de sacarose utilizado para separar as membranas extraídas de Freis, cepa vacinal viva, proteínas da membrana externa ou OMPs, localizadas entre densidades de 1,17 e 1,2 gramas por mililitro.Por comparação, as proteínas da membrana interna ou ips localizaram-se entre densidades de 1,13 e 1,14 gramas por mililitro. Resultados semelhantes foram obtidos para a linhagem FHU quatro. Acabei de demonstrar como extrair e isolar vesículas da membrana externa de Francisella por meio de lise osmótica e ultracentrifugação em gradiente de densidade de sacarose.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar células bacterianas nas fases iniciais da fase logarítmica de crescimento, diluindo-as lentamente, porém de forma constante, em água desionizada durante a etapa de glicoproteção osmótica, e ter cuidado ao ressuspender os pellets da membrana provenientes da ultracentrifugação. Isso conclui o nosso procedimento de separação de membranas. Obrigado por assistir e boa sorte em seus futuros experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Cian, M. B. et. al., Separação do Envelope Celular para Bactérias Gram-negativas em Frações de Membrana Interna e Externa com Ajustes Técnicos para Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra a separação das frações de membrana interna e externa de bactérias Gram-negativas usando ultracentrifugação com gradiente de sacarose. As frações de membrana são purificadas e armazenadas em baixas temperaturas para análise direcionada de componentes específicos da membrana.

Separação de Frações de Membrana Interna e Externa de Bactérias Gram-Negativas

Fonte: Watson, D. C., et.al. Isolamento e purificação escaláveis de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra o isolamento e a concentração de vesículas extracelulares (EVs) derivadas da membrana externa de bactérias geneticamente modificadas. O processo envolve a cultura das bactérias para liberar EVs, seguido por etapas sequenciais de centrifugação e filtração para remover células e detritos. Finalmente, a ultrafiltração é usada...

Isolamento e Enriquecimento de Vesículas Extracelulares Derivadas da Membrana Externa de Bactérias

Fonte: Jung, A. L., et al. Vesículas da membrana externa da Legionella pneumophila : Isolamento e análise de seu potencial pró-inflamatório em macrófagos. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o isolamento das vesículas de membrana externa (OMVs) da Legionella pneumophila usando centrifugação sequencial, filtração estéril e ultracentrifugação. Os OMVs purificados, enriquecidos em proteínas de membrana e lipopolissacarídeos, são adequados para estudos de interação hospedeiro-patógeno.

Isolamento baseado em ultracentrifugação das vesículas externas da membrana Legionella pneumophila

Este protocolo descreve inoculações intratraqueal de Fischer 344 ratos com Francisella tularensis. Este procedimento imita pulmonar exposição dos seres humanos a este potencial agente de ameaça biológica e pode ser usado para testar a vacina e a eficácia terapêutica contra tularemia pulmonar.

Intratraqueal inoculação de Fischer 344 ratos com Francisella tularensis

Este método fornece um quadro para estudar a incorporação de ácidos graxos exógenos de fontes hospedeiras complexas em membranas bacterianas, particularmente Staphylococcus aureus. Para conseguir isto, os protocolos para o enriquecimento de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha e do perfil de ácido gordo subseqüente de fosfolipídios bacterianos que utilizam a espectrometria maciça são descritos.

Isolação de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha para o estudo da incorporação do ácido gordo do micróbio patogénico bacteriano em phospholipids da membrana

Mycobacterium tuberculosis mostra aumento da produção e liberação de vesículas extracelulares em resposta às condições de baixo ferro. Este trabalho detalha um protocolo para gerar condições e métodos baixos de ferro para a purificação e caracterização de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas em resposta à deficiência de ferro.

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas por ferro

Bactérias gram-negativas produzem duas membranas espacialmente segregadas. A membrana externa é particionada da membrana interna por um periplasma e uma camada peptidoglicana. A capacidade de isolar as bicamadas duplas desses micróbios tem sido fundamental para a compreensão de sua fisiologia e patogênese.

Separação do envelope celular para bactérias gram-negativas em frações de membrana interna e externa com ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii

As vesículas bacterianas desempenham papéis importantes na patogênese e têm aplicações biotecnológicas promissoras. A heterogeneidade das vesículas complica a análise e o uso; portanto, é necessário um método simples e reprodutível para separar diferentes tamanhos de vesículas. Aqui, demonstramos o uso da cromatografia de exclusão de tamanho para separar vesículas heterogêneas produzidas por Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Cromatografia de exclusão de tamanho para analisar heterogeneidade vesícula de membrana externa bacteriana

As bactérias secretam vesículas extracelulares (EVs) de tamanho nanométrico que transportam moléculas biológicas bioativas. A pesquisa EV se concentra na compreensão de sua biogênese, papel nas interações micróbio-micróbio e hospedeiro-micróbio e doença, bem como suas potenciais aplicações terapêuticas. Um fluxo de trabalho para isolamento escalável de EVs de várias bactérias é apresentado para facilitar a padronização da pesquisa de EV.

Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

Este protocolo descreve como usar a microscopia TIRF para rastrear canais iônicos individuais e determinar sua atividade em membranas lipídicas suportadas, definindo assim a interação entre o movimento da membrana lateral e a função do canal. Ele descreve como preparar as membranas, registrar os dados e analisar os resultados.

Imagem de molécula única da mobilidade lateral e atividade do canal iônico em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF)

Embora os procariontes não tenham um sistema organelar, existem regiões subcelulares com proteínas localizadas. A análise quantitativa e qualitativa das enzimas e proteínas nas regiões subcelulares é importante para o desenvolvimento de alvos de fármacos e vacinas. Aqui, ilustramos o fracionamento subcelular de proteínas Leptospiras usando Triton X-114 e sua análise.

Enriquecimento de proteínas subcelulares em Leptospira usando uma abordagem de fracionamento baseada em Triton X-114

Aprenda a isolar vesículas de membrana externa de Francisella tularensis por lise osmótica e ultracentrifugação em gradiente de sacarose. Este método permite estudar proteínas de membrana e patogenicidade bacteriana.

Método para o isolamento de Francisella tularensis Membranas externas

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