FCM-IP: Imunoprecipitação Detectado por citometria de fluxo

Nos experimentos IP FCM, complexos de proteínas são capturados em grânulos para identificar e estudar as diferentes proteínas que interagem entre si. Primeiro, um anticorpo imunoprecipitante específico para proteína de interesse é acoplado covalentemente a esferas de látex de poliestireno. Como segundo passo, esses grânulos são incubados com lisados celulares, permitindo que a proteína específica e as proteínas que interagem se liguem aos grânulos.

As esferas junto com as proteínas capturadas e, em seguida, lavadas e sondadas com anticorpos marcados com fluorescência específicos para várias moléculas que podem estar associadas à proteína imunoprecipitada. Finalmente, os grânulos marcados com fluorescência são analisados por citometria de fluxo para determinar quais proteínas estão presentes nas quais você está ausente dos complexos capturados. As vantagens dessa técnica sobre outros métodos, como imunoprecipitação, seguida de western blotting, é a capacidade do IPFCM de permitir a avaliação das interações proteína-proteína nativa sem a necessidade de engenharia genética ou grandes tamanhos de amostra.

O I-P-F-C-M pode produzir uma alta relação sinal-ruído, mesmo quando muito pouco biomaterial está disponível para análise, pois pode ser realizado com pequenos volumes e baixas concentrações de analitos. Para iniciar este procedimento, prepare os seguintes tampões: acoplamento MES, tampão de armazenamento de bloqueio de têmpera de tampão, QBS abreviado e citometria de fluxo ou tampão FCM. Determinar a concentração dos grânulos de látex de poliestireno modificado com carboxilato ou grânulos de LMC diluindo em PBS e contando com um hemocitômetro.

Uma vez determinada a concentração dos grânulos, pipete 18 vezes 10 para os seis grânulos em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Lave os grânulos duas a três vezes em 0,5 a um mililitro de tampão de acoplamento MES centrifugando a 20.000 vezes a gravidade por três minutos à temperatura ambiente. Após cada lavagem, enquanto as esferas estão centrifugando.

Prepare um novo tampão MES e dac para uso na ativação dos grânulos. Quando as lavagens estiverem concluídas, mantenha o tampão em temperatura ambiente ou no gelo. Após a lavagem final, ressuspenda os grânulos em 50 microlitros do tampão de acoplamento MES.

Em seguida, adicione 20 microlitros de EEC MES à suspensão do grânulo. Para ativar os grupos carboxila nas contas, misture suavemente à temperatura ambiente, pipetando manualmente para cima e para baixo continuamente por 15 minutos. Embora esta etapa seja trabalhosa, este método de mistura oferece os melhores resultados após a mistura.

Lave os grânulos ativados duas a três vezes em 0,5 a um mililitro de PBS Centrifusion 20.000 vezes. Gravidade por três minutos à temperatura ambiente Após cada lavagem após a lavagem final, ressuspenda os grânulos ativados em 50 microlitros de PBS para acoplar o anticorpo IP aos grânulos. Adicione 50 microlitros do anticorpo monoclonal IP de uma concentração estoque entre 0,2 a um miligrama por mililitro.

Certifique-se de que nenhuma amina primária contendo moléculas além do anticorpo esteja presente. Essas moléculas contendo aminas, como tris ou albumina de soro bovino, competem com o anticorpo pelo acoplamento às contas. Misture a suspensão de anticorpos do grânulo em um agitador vibratório por três a quatro horas em temperatura ambiente.

Agite o suficiente para evitar que as contas se assentem no fundo do tubo. Após a encadernação. Lave as esferas de bacalhau de anticorpos duas a três vezes em 0,5 a um mililitro de PBS centrifugando 20.000 vezes.

Gravidade por três minutos em temperatura ambiente após cada lavagem. Por fim, ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de tampão QBS. O acoplamento de anticorpos monoclonais aos grânulos de LMC pode ser verificado colorindo os grânulos com anticorpos conjugados fluro contra IgG.

Seguido pela análise FCM, os grânulos revestidos com o anticorpo monoclonal podem ser armazenados a quatro graus Celsius até que estejam prontos para uso em um experimento IP. Primeiro, suspenda bem as contas, dilua de um a 200 a um a 10.000 em PBS e conte com um hemocitômetro. A concentração deve ser medida para cada lote preparativo para que o número de grânulos usados em cada experimento IP possa ser controlado com precisão.

Em seguida, prepare a solução de escavação fresca em água a 2% de peso por volume. Aqueça a 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, deixe esfriar no gelo.

Diluir, cavar em 1% de peso por volume em lise recém-preparada, tampão e manter no gelo. Determine o número de células a serem lidas usando a tabela mostrada como diretriz. No entanto, o número de células necessárias depende da proteína de interesse e deve ser determinado empiricamente.

Aqui, 30 vezes 10 elevado a seis células de uma pequena linhagem de células tumorais linfocíticas são usadas. Transfira o volume de suspensão da célula necessário para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Pulverize as células 20.000 vezes.

Gravidade por 30 segundos a quatro graus Celsius e aspirar a mídia. Adicione a quantidade adequada de preparado na hora. Cave o tampão de lise no pellet misturado suavemente, pipetando para cima e para baixo.

Em seguida, deixe as células cortarem por 20 minutos no gelo. Observe que, dependendo do tipo de célula e das interações proteína-proteína estudadas, as condições de lise celular podem variar e devem ser determinadas empiricamente quando a lise estiver completa. Remover os núcleos e os detritos celulares insolúveis centrifugando o lisado 20 000 vezes.

Gravidade, os 10 minutos a quatro graus Celsius. Mantenha o SNA e descarte o pellet para ligar a proteína alvo aos grânulos revestidos com anticorpos. Adicione 50.000 a 250.000 grânulos acoplados a anticorpos monoclonais ao lisado clarificado, pipetando suavemente.

Para misturar, o volume mínimo de lisado usado para um único IP é de cinco microlitros. Coloque o lisado clarificado e a mistura de grânulos em uma roda vertical rotativa por quatro horas a durante a noite em uma câmara fria ajustada a uma velocidade suficiente para evitar que os grânulos se assentem abaixo do volume ips, o líquido pode permanecer no fundo do tubo durante a rotação. Após a ligação da proteína alvo ao anticorpo IP.

Prossiga para a marcação fluorescente do imunocomplexo. Lave as esferas IP duas vezes em um mililitro de gelo chamado tampão FCM, centrifugando a 20.000 vezes a gravidade por três minutos a quatro graus Celsius. Após cada lavagem, suspenda novamente as esferas em 100 microlitros de tampão FCM e alíquota de 20 microlitros em cada um dos cinco ou mais.

1,5 mililitro micro tubos de centrífuga ou poços de uma placa inferior de chaminé. Ambos são mostrados aqui. Adicione anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromo às amostras.

Execute a coloração FCM seguindo as instruções do fornecedor ou de acordo com concentrações determinadas empiricamente como ponto de partida. Adicione 0,2 a um microlitro de solução de anticorpo estoque de pelo menos 0,1 miligramas por mililitro por tubo ou poço e incube por 40 minutos no gelo. Lave as contas sondadas em tubos de 1,5 mililitro duas vezes com um mililitro de gelo frio.

Tampão FCM, centrifugando 20.000 vezes. Gravidade a quatro graus Celsius por três minutos. Após cada lavagem, remova suavemente o supinado após cada lavagem, tomando cuidado para não perturbar as contas.

Alternativamente, para uma chaminé, a placa inferior lava duas vezes com 0,2 mililitros de gelo frio, o tampão FCM centrifuga a 1000 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após cada lavagem, após cada lavagem. Para remover o sobrenadante das contas, sacuda a placa uma vez e, ainda de cabeça para baixo, seque as gotas das bordas dos poços.

O volume residual em cada poço contendo as esferas será de cerca de 20 microlitros. Suspenda as esferas em 200 microlitros de buffer FCM por transferência de amostra para tubos de fax rotulados. As amostras agora estão prontas para citometria de fluxo ou FCM em Becton Dickens e citômetros de fluxo.

Remova a luva de contenção de gotículas que pode envolver a entrada ou gole de amostra. Deixe o gole pingar entre as amostras, pois isso evitará que as contas sejam transportadas de uma amostra para outra. As contas de LMC usadas aqui têm de três a cinco micrômetros de diâmetro, aproximadamente metade do diâmetro de um linfócito de camundongo quiescente.

Portanto, pode ser necessário aumentar manualmente o ganho de amperagem de dispersão direta e a tensão de dispersão lateral para a população de eventos de cordão. Para se registrar no citômetro aqui, isso é feito usando contas não rotuladas ou em branco. As configurações na marcha são ajustadas para excluir talão, gibões e abri antes da leitura.

Amostras experimentais garantem que a fluorescência esteja em escala. As esferas não rotuladas servem como controle negativo da fluorescência e as partículas de calibração do arco-íris ou RCPs podem ser usadas como controle positivo da fluorescência. Como os RCPs são menores que as contas da LMC, os parâmetros de dispersão para frente e lateral, bem como a posição da marcha, podem precisar ser alterados temporariamente para essa amostra.

Após essas calibrações, os extremos de fluorescência negativa e positiva são visualizados em um eixo logarítmico. Quando a calibração com RCPs estiver concluída, retorne às configurações de contas não rotuladas para dispersão direta e lateral. Desde que apenas uma sonda fluorescente por amostra seja usada, como no experimento mostrado aqui, nenhuma compensação de fluorescência é necessária.

Agora adquira e salve os arquivos de dados de fluorescência, a análise é realizada posteriormente usando um software de citometria de fluxo, como cell Quest ou FlowJo. Aqui está o resultado de uma análise IP FCM da célula T de camundongo LY em 1% de dígitos toin. O complexo TCR CD três não proteicos foi puxado para baixo com três grânulos épsilon anti CD.

Os complexos capturados contêm quantidades significativas de TCR beta e co associado a CD três épsilon. Níveis próximos ao fundo de outras proteínas foram detectados conforme determinado usando uma sonda de imunoglobulina irrelevante ou anticorpos contra as proteínas TH 1.2, CD 45 ou H dois KD. As vantagens dessa técnica sobre outros métodos, como imunoprecipitação, seguida de western blotting, é a capacidade do IPFCM de permitir a avaliação das interações proteína-proteína nativa sem a necessidade de engenharia genética ou grandes tamanhos de amostra. O I-P-F-C-M pode produzir altas relações sinal-ruído, mesmo quando muito pouco biomaterial está disponível para análise, pois pode ser realizado com pequenos volumes e baixas concentrações de analitos.