Name: FCM-IP: Imunoprecipitação Detectado por citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Aprenda a técnica IP-FCM para analisar interações proteína-proteína nativas usando citometria de fluxo. Este método permite detectar complexos proteicos com alta sensibilidade em amostras pequenas.

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Este trabalho foi financiado pelo Prêmio Inovação Eagles (Ordem Fraternal de Eagles) e pela Fundação Mayo.

** Este protocolo de vídeo é baseado em uma publicação associada 1: alta sensibilidade de detecção e análise quantitativa dos nativos interações proteína-proteína e complexos multiprotein por citometria de fluxo. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel, Ed Palmer. STKE da ciência 2007 (389): PL2, 05 de junho de 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">Clique aqui para ver esta publicação</a> . Antes de iniciar, preparar o seguinte stock Soluções aquosas: <table><tbody><tr><td> MES tampão de acoplamento: </td><td> Armazenar a 25 ° C </td></tr><tr><td> MES, pH 6,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Têmpera / Bloqueio / Storage (SBQ) Buffer: </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Azida de sódio </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Tampão FCM: </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Tris, pH 7,4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> Azida de sódio </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> 1x </td></tr></tbody></table> Prepare imediatamente antes da utilização: <table><tbody><tr><td> EDAC-MES: </td><td> Dissolver 50 mg / mL em pó EDAC MES tampão de acoplamento </td></tr><tr><td> Digitonina solução (2% w / v): </td><td> Dissolva o pó digitonina em dH 2 O por aquecimento a 95 ° C por 5min, em seguida de resfriamento em gelo </td></tr><tr><td> Tampão de Lise: </td><td></td></tr><tr><td> Tris, pH 7,4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mm </td></tr><tr><td> Solução digitonina </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Inibidores da Protease </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Manter no gelo </td><td></td></tr></tbody></table> 1. Acoplamento de mAb de Contas <ol><li> Determinar a concentração de contas do estoque adquirido por diluindo em PBS e contando com um hemocitômetro. Comece com uma diluição de 1:10000 de contas para a contagem. </li><li> Pipetar 18 x 10 6 contas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Lavar as contas 2 a 3 vezes em 0,5-1,0 mL de buffer Coupling MES, centrifugação a 20.000 g por 3 minutos a 25 ° C após cada lavagem. </li><li> Volte a suspender as contas em 50 mL de buffer Coupling MES. </li><li> Ativar os grupos carboxila nas contas de adição de 20 mL de recém-preparados EDAC-MES. </li><li> Misture delicadamente por 15 min a 25 ° C por manualmente pipetando para cima e para baixo. </li><li> Lave as contas ativadas 2 a 3 vezes em 0,5 a 1,0 mL PBS, centrifugação a 20.000 g por 3 minutos a 25 ° C após cada lavagem. </li><li> Volte a suspender as contas ativadas em 50 mL de PBS. </li><li> Adicionar 50 mL do mAb IP (a concentração de ações 0,2-1,0 mg / mL) à solução ativada talão. </li><li> Misture por 3 a 4 horas a 25 ° C, colocando o tubo em um shaker vibrando. Agitar o suficiente para impedir que a resolução das esferas no fundo do tubo. </li><li> Lavar mAb-coupled contas 2 a 3 vezes em 0,5 a 1,0 mL PBS, centrifugação a 20.000 g por 3 minutos a 25 ° C após cada lavagem. </li><li> Volte a suspender as contas em 100 mL de buffer SBQ. Estes podem ser armazenados a 4 ° C. </li><li> Suspendendo as contas assim, diluir 1:200-1:10,000 em PBS e contar com um hemocitômetro. A concentração deve ser medido para cada lote preparativa, de modo que o número de contas utilizadas em cada experimento IP ou pull-down pode ser controlada com precisão. </li></ol> 2. Pós-nuclear Preparação Lysate e Ip O método de lise e as condições de lise vai depender do tipo de célula e interações proteína-proteína em análise. Uma série de protocolos existem e podem ser modificados para sua aplicação. <ol><li> Lyse 20 x 10 6 'pequena' células, como linfócitos, ou 5 x 10 6 'grande' células, como macrófagos ou células tumorais, em 100 mL de buffer Lysis fresco em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL por 20min no gelo. Escala o volume de lise, conforme necessário. </li><li> Para remover núcleos e restos celulares insolúveis, centrifugar o lisado em 20.000 g por 10 min a 4 ° C. Manter o sobrenadante e descartar o pellet. </li><li> Adicionar 0,5 x 10 5 a 2,5 x 10 5 mAb-coupled contas ao lisado clarificado, pipetagem cuidadosamente para misturar. O volume mínimo que usamos pararealizar um único IP está a 5 mL. </li><li> Coloque em uma roda giratória verticais 4 horas durante a noite em uma sala fria. Definir a velocidade suficiente para impedir as contas de liquidação. É aceitável que o líquido de baixo volume de IPs para permanecer no fundo do tubo durante a rotação. </li></ol> 3. Sondagem da Bead-capturado Protein com fluorocromo-Anticorpos <ol><li> Lave as contas IP duas vezes em 0,2-1,0 mL gelada buffer FCM, centrifugação a 20.000 g a 4 ° C por 3 min após cada lavagem. </li><li> Volte a suspender as contas em 100 FCM Buffer e alíquota 20 mL mL em cada um dos cinco ou mais tubos de 1,5 mL de microcentrífuga ou poços de uma placa de fundo da chaminé. </li><li> Adicionar fluorocromo-mAbs às amostras. Executar a FCM mancha de acordo com instruções do fornecedor ou de acordo com as concentrações de determinados empiricamente. Como ponto de partida, adicione 0,2-1 mL de solução anticorpo estoque (em 0,2-1,0 mg / mL) por tubo ou bem, e incubar por 40 min no gelo. </li><li> Lavar sondado contas em 1,5 ml tubos duas vezes em 1,0 mL de buffer FCM gelada, centrifugação a 20.000 g a 4 ° C por 3 min após cada lavagem. Remova cuidadosamente o sobrenadante após cada lavagem, tendo o cuidado para não perturbar as contas. Por um prato de chaminé inferior, lave duas vezes com 0,2 mL gelada buffer FCM, centrifugação a 1000g por 5 min a 4 ° C após cada lavagem. Um pipetador multicanal é útil para esta etapa. Para remover o sobrenadante de contas em um prato fundo da chaminé, 'filme' da placa de uma vez, então, ainda de cabeça para baixo, blot qualquer pinga das bordas dos poços. O volume residual em cada poço, contendo as contas, serão cerca de 20 mL. </li><li> Volte a suspender as contas em 200 mL de buffer FCM por amostra. Transferência para tubos rotulados FACS. Amostras estão agora prontos para FCM. </li></ol> 4. FCM Aquisição As contas CML descritos neste protocolo são 3-5 m de diâmetro, aproximadamente metade do diâmetro de um linfócito do mouse quiescente. Portanto, pode ser necessário aumentar manualmente o Forward Scatter (FSC) ganho ampères e Side Scatter (SSC) de tensão para que a população de eventos talão de registrar em escala. Contas individuais IP devem formar uma única população bem agrupado. As configurações e portão deve ser ajustado para excluir doublets talão e detritos. <ol><li> Antes de contas correntes ou padrões de talão, remova o adaptador de contenção de gotículas que circunda a entrada da amostra em alguns citómetros. Permitir que o fluido bainha a escorrer entre as amostras, pois isso irá limpar a entrada e evitar contas de serem transitadas de uma amostra para outra. </li><li> Use contas sem rótulo, um controle negativo de fluorescência, e Partículas Calibração Rainbow (PCRs), um controle positivo de fluorescência, para ajustar as configurações de modo que ambos os extremos negativos e positivos de fluorescência aparecem simultaneamente no log escala de eixo-x. Isso garante que a fluorescência das amostras experimentais também será on-escala. Note-se que PCRs são menores do que as contas da CML, para FSC e SSC parâmetros, bem como a posição portão, pode precisar ser temporariamente alteradas para que a amostra. </li><li> Return to-grânulo unlabeled configurações vez de calibração com PCRs é completo. Se apenas uma sonda fluorescente por amostra é usada, nenhuma compensação de fluorescência é necessário. Em geral, complexos multiprotein sonda com um único fluorocromo-mAb por amostra FCM, e examinamos vários parceiros de interação através da coloração paralelo amostras talão com mAbs específicos para as subunidades diferentes. </li><li> Adquirir e salvar arquivos de fluorescência de dados. Análise pode ser realizada utilizando software citometria de fluxo, tais como CellQuest, programa FlowJo, ou cflow. </li></ol> 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Células IP FCM para TCR/CD3 complexo multiprotein. T a partir da estirpe camundongo BALB / c foram lisadas em digitonina 1%, eo lisado foi submetido a IP-FCM usando anti-CD3ε contas. Os complexos capturado contidas quantidades significativas de TCR-β (região roxo) e co-associados CD3-ε (verde), mas perto dos níveis de fundo (definida pela sonda imunoglobulina irrelevante, rosa trace) de outras proteínas, como Thy1.2, CD45, ou H-2K (d) (marrom, laranja e vestígios azul, respectivamente). Veja resultados semelhantes publicados anteriormente 1-6.

<ol><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8%2B+memory+versus+effector+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li>
<li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and%2For+calcium+store+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li>
<li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li>
</ol>

Informações sobre interações proteína-proteína é altamente relevante para a análise de muitos processos celulares, tais como transdução de sinal, a maturação linhagem, progressão do ciclo celular, apoptose e cascatas. FCM-IP oferece uma maneira rápida, quantitativa e sensíveis para analisar a interação de proteínas e definir os membros de complexos multiprotein em sua conformação nativa. Esferas podem ser acoplados e incubadas com lisados ​​celulares em um dia e pode ser sondado e analisadas no dia seguinte. Um formato de placa de 96 poços permite um grande número de amostras a serem analisadas de uma só vez para a coleta de dados eficiente para fins estatísticos ou de triagem. Usando fluorescentes padrões talão, o número de proteínas capturados por cada talão pode ser estimada. Muito pouco material de origem é necessária para a captura e detecção, de forma limitada e amostras de analitos escassos ainda podem ser analisados ​​para múltiplas interações. Apesar de IP FCM-não requer engenharia genética, epítopo-tagging, desnaturação, ou in-vitro mistura de proteínas em um ambiente não-fisiológica, pode ser acoplado com estas e outras técnicas, tornando-se um instrumento valioso e acessível, com aplicabilidade a muitos sistemas biológicos. Solução de problemas: Muitos IP-FCM experimentos geram dados de interação de proteínas úteis na primeira vez que são tentados. Entretanto, a otimização da FCM-IP pode melhorar a conjugação de anticorpos para contas, captação de proteínas complexas, e sonda fluorescente vinculativo. A eficiência de conjugação de anticorpos IP pode ser determinada pela sondagem contas acoplado diretamente com um anticorpo anti-imunoglobulina. Se essa eficiência é baixa, aumentando a concentração de anticorpos durante a reação de acoplamento podem permitir mais anticorpos IP para anexar a cada esfera. Isto pode aumentar a capacidade de ligação do lote IP talão, resultando na captura avançada e detecção de analitos. Outros primário-amina contendo moléculas (por exemplo, Tris, albumina de soro bovino) não deve estar presente durante a reação de acoplamento, uma vez que estas possam competir com o mAb para talão de fixação, resultando em acoplamento mAb baixo. Se conjugação de mAb aos grânulos prova problemático por outros motivos, ao invés contas pode ser acoplado a avidina / estreptavidina, e anticorpos biotinilados pode, posteriormente, ser não-covalente e usado para immunprecipitation. Apesar de conjugação de anticorpos boa, a detecção inicial de talão associado fluorescência pode ser baixo. Captura, primeiro complexo em si pode ser baixa. Porque o IP-FCM depende da concentração de analitos, aumentando o número de células lisadas por volume de unidade de lise pode aumentar a captura e detecção do analito. Além disso, a captura pode ser aumentada pela diminuição do número de contas IP incubadas com o lisado, que distribui complexos capturado em contas de menos, e resulta em aumento de fluorescência média por talão quando sondada. Em segundo lugar, é possível que o acesso do anticorpo sonda para os complexos capturada é estericamente impedidas pelo anticorpo immunoprecipitating. Neste caso, o problema pode ser resolvido utilizando anticorpos diferentes para capturar e / ou sonda.

<table><tbody><tr><td>esferas de látex de poliestireno modificadas com carboxilato (CML) (5 mm, sem surfactante)</td><td>Reagente</td><td>Interfacial Dynamics</td><td>2-5000</td><td>Armazenar a 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Partículas de calibração Rainbow</td><td>Reagente</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>RCP-30-5A</td><td>Armazenar a 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Ácido 2-[N-morpholino] etanosulfônico (MES)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5287</td><td></td></tr><tr><td>1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida HCl (EDAC)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22980 E-6383</td><td>Armazenar a -20&amp;#x00B0;C em condições dessecantes.</td></tr><tr><td>Cocktail geral de inibidores de protease, contendo AEBSF, Bestatina, Aprotinina, EDTA, E-64 e Leupeptina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2714</td><td>Preparar solução estoque 100x em H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Aliquotar e armazenar a -20&amp;#x00B0;C. Manipular com luvas.</td></tr><tr><td>Placas de PCR, 96 poços, 0,2 mL, cor natural, com paredes altas</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-230</td><td>Para uso no lugar de tubos de microcentrífuga durante a coloração por FCM</td></tr></tbody></table>

fcm-ip: imunoprecipitação detectado por citometria de fluxo

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Imunoprecipitação detectada por citometria de fluxo (IP-FCM) é um método eficiente para a detecção e quantificação de interações proteína-proteína. O princípio básico que se estende de ELISA sanduíche, onde o analito capturado primária pode ser detectado em conjunto com outras moléculas associadas fisicamente dentro de complexos multiprotein. O procedimento envolve o acoplamento covalente de microesferas de látex de poliestireno com immunoprecipitating anticorpos monoclonais (mAb) específico para uma proteína de interesse, incubando estas contas com lisados ​​celulares, sondagem complexos de proteína capturadas com fluorocromo-sondas, e análise de talão associado fluorescência por citometria de fluxo. FCM-IP é extremamente sensível, permite a análise de proteínas em sua nativa (não-desnaturado) do estado, e é passível de qualquer análise semi-quantitativa ou quantitativa. Como vantagens adicionais, IP-FCM não requer engenharia genética ou equipamentos especializados, além de um citômetro de fluxo, e pode ser facilmente adaptado para aplicações de alto rendimento.

O método IP-FCM é apresentado, o que permite uma sensível, avaliação, robusto bioquímica de espécies nativas interações proteína-proteína, sem a necessidade de engenharia genética ou grandes amostras.

FCM-IP: Imunoprecipitação Detectado por citometria de fluxo

A imunoprecipitação detectada por citometria de fluxo (IP-FCM) é um método eficiente para detectar e quantificar interações proteína-proteína. O básico...

Nos experimentos de FCM por IP, complexos proteicos são capturados em microesferas para identificar e estudar as diferentes proteínas que interagem entre si. Primeiro, um anticorpo imunoprecipitante específico para a proteína de interesse é acoplado covalentemente a microesferas de látex de poliestireno. Em um segundo passo, essas microesferas são incubadas com lisados celulares, permitindo que a proteína específica e as proteínas interagentes se liguem às microesferas.As esferas, juntamente com as proteínas capturadas, são então lavadas e incubadas com anticorpos marcados com fluoróforos específicos para diversas moléculas que possam estar associadas à proteína imunoprecipitada. Por fim, as esferas marcadas com fluoróforos são analisadas por citometria de fluxo para determinar quais proteínas estão presentes e quais estão ausentes nos complexos capturados. As vantagens dessa técnica em comparação com outros métodos, como imunoprecipitação seguida de western blot, incluem a capacidade do I-P-F-C-M de permitir a avaliação de interações proteína-proteína nativas, sem a necessidade de engenharia genética ou grandes tamanhos de amostra.I-P-F-C-M pode gerar uma alta relação sinal-ruído mesmo quando há pouca biomaterial disponível para análise, pois pode ser realizada com pequenos volumes e baixas concentrações de analitos. Para iniciar este procedimento, prepare os seguintes tampões: MES de acoplamento, tampão de bloqueio de quenching, tampão de armazenamento, abreviado como QBS, e tampão para citometria de fluxo ou FCM. Determine a concentração das microesferas de látex de poliestireno modificadas com carboxilato ou microesferas CML diluindo em PBS e contando com um hemocitômetro.Uma vez determinada a concentração das microesferas, pipete 18 vezes 10 elevado a seis microesferas em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro. Lave as microesferas de duas a três vezes em 0,5 a um mililitro de tampão de acoplamento MES, centrifugando a 20.000 vezes a gravidade durante três minutos à temperatura ambiente. Após cada lavagem, enquanto as microesferas estão sendo centrifugadas.Prepare um tampão MES e dac fresco para usar na ativação das esferas. Após a conclusão das lavagens, mantenha o tampão em temperatura ambiente ou sobre gelo. Após a última lavagem, re-suspenda as esferas em 50 microlitros do tampão de acoplamento MES.Em seguida, adicione 20 microlitros de MES EEC à suspensão de esferas. Para ativar os grupos carboxila nas esferas, misture suavemente à temperatura ambiente pipetando para cima e para baixo continuamente durante 15 minutos. Embora esta etapa seja trabalhosa, este método de mistura fornece os melhores resultados após a mistura.Lave as esferas ativadas duas a três vezes em 0,5 a um mililitro de PBS Centrifusion a 20.000 × g por três minutos à temperatura ambiente. Após cada lavagem e após a lavagem final, reconstitua as esferas ativadas em 50 microlitros de PBS para acoplar o anticorpo IP às esferas. Adicione 50 microlitros do anticorpo monoclonal IP a partir de uma concentração estoque entre 0,2 e um miligrama por mililitro.Certifique-se de que não haja moléculas contendo aminas primárias além do anticorpo presentes. Essas moléculas contendo aminas, como tris ou albumina de soro bovino, competem com o anticorpo pelo acoplamento às microesferas. Misture a suspensão de anticorpo em microesferas em um agitador vibratório por três a quatro horas à temperatura ambiente.Agite suficientemente para evitar a sedimentação das esferas no fundo do tubo. Após a ligação, lave as esferas conjugadas com anticorpo duas a três vezes em 0,5 a um mililitro de PBS, centrifugando a 20.000 × g.Centrifugue por três minutos à temperatura ambiente após cada lavagem. Por fim, ressuspenda as microesferas em 100 microlitros de tampão QBS. O acoplamento de anticorpos monoclonais às microesferas CML pode ser verificado por coloração das microesferas com anticorpos conjugados a fluorocromos contra IgG.Após a análise por FCM, as microesferas revestidas com o anticorpo monoclonal podem ser armazenadas a quatro graus Celsius até o momento de uso em um experimento de IP. Primeiro, suspenda bem as microesferas, diluindo-as de 1:200 a 1:10.000 em PBS, e conte com um hemocitômetro. A concentração deve ser medida para cada lote preparado, de modo que o número de microesferas utilizado em cada experimento de IP possa ser controlado com precisão.Em seguida, prepare uma solução fresca de dig em água a 2% peso por volume. Aqueça a 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, resfrie em gelo.Dilua e digira em 1% peso por volume em tampão de lise recém-preparado e mantenha em gelo. Determine o número de células a ser lisado utilizando a tabela apresentada como orientação. No entanto, o número de células necessário depende da proteína de interesse e deve ser determinado empiricamente.Aqui, são utilizadas 30 vezes 10 à sexta células de uma linhagem celular de tumor linfocítico pequeno. Transfira o volume necessário da suspensão celular para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Pelotize as células a 20.000 vezes.Centrifugar por 30 segundos a quatro graus Celsius e aspirar o meio. Adicione a quantidade apropriada de tampão de lise Dig recém-preparado ao pellet, misturando suavemente por pipetagem para cima e para baixo.Em seguida, deixe as células lisarem por 20 minutos no gelo. Observe que, dependendo do tipo celular e das interações proteína-proteína estudadas, as condições de lise celular podem variar e devem ser determinadas empiricamente quando a lise estiver completa. Remova os núcleos e os detritos celulares insolúveis centrifugando o lisado a 20.000 vezes.Centrifugue devido à gravidade por 10 minutos a quatro graus Celsius. Mantenha o sobrenadante e descarte o pellet para ligar a proteína alvo aos grânulos revestidos com anticorpo. Adicione de 50.000 a 250.000 grânulos conjugados com anticorpo monoclonal ao lisado clarificado, pipetando suavemente.Para misturar o volume mínimo de lisado utilizado para um único IP, são cinco microlitros. Coloque a mistura de lisado clarificado e as perlas em uma roda vertical rotatória por quatro horas a durante a noite em uma câmara fria ajustada a uma velocidade suficiente para impedir que as perlas sedimentem abaixo dos volumes de IP; o líquido pode permanecer na parte inferior do tubo durante a rotação. Após a ligação da proteína-alvo ao anticorpo de IP.Prossiga para a marcação fluorescente do complexo imunológico. Lave as microesferas de IP duas vezes em um mililitro de tampão FCM gelado, centrifugando a 20.000 × g por três minutos a quatro graus Celsius. Após cada lavagem, re-suspenda as microesferas em 100 microlitros de tampão FCM e alíquota 20 microlitros em cada uma de cinco ou mais tubos.Tubos microcêntrifugos de 1,5 mililitro ou poços de uma placa de fundo tipo chaminé. Ambos são mostrados aqui. Adicione anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromo às amostras.Realize a coloração por FCM seguindo as instruções do fabricante ou de acordo com concentrações determinadas empiricamente como ponto inicial. Adicione de 0,2 a uma microlitro da solução estoque de anticorpo de pelo menos 0,1 miligrama por mililitro por tubo ou poço e incube por 40 minutos no gelo. Lave as microesferas marcadas em tubos de 1,5 mililitro duas vezes com um mililitro de solução fria. Tamp&atilde;o de FCM, centrifugando a 20.000 vezes a gravidade a quatro graus Celsius durante tr&ecirc;s minutos. Ap&oacute;s cada lavagem, remova cuidadosamente o sobrenadante ap&oacute;s cada lavagem, tomando cuidado para n&atilde;o perturbar as microesferas.Alternativamente, para uma chaminé, lave a placa inferior duas vezes com 0,2 mililitros de tampão FCM gelado, centrifugando a 1000 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Após cada lavagem, após cada lavagem. Para remover o sobrenadante das perolas, agite a placa uma vez e, mantendo-a ainda virada para baixo, absorva quaisquer gotas nas bordas dos poços.O volume residual em cada poço contendo as microesferas será de aproximadamente 20 microlitros. Suspenda as microesferas em 200 microlitros de tampão FCM por amostra e transfira para tubos fax rotulados. As amostras estão agora prontas para citometria de fluxo ou FCM em citômetros Becton Dickinson e de fluxo.Remova a manga de contenção de gotas que pode envolver a entrada da amostra ou o bico. Deixe o bico gotejar entre as amostras, pois isso impedirá que as microesferas sejam transferidas de uma amostra para outra. As microesferas de CML utilizadas aqui têm de três a cinco micrômetros de diâmetro, aproximadamente metade do diâmetro de um linfócito de camundongo em repouso.Portanto, pode ser necessário aumentar manualmente o ganho do amplificador de dispersão direta e a voltagem da dispersão lateral para que a população de eventos das partículas seja registrada no citômetro. Para isso, utilizam-se partículas não marcadas ou partículas brancas. As configurações no software GAIT são ajustadas para excluir partículas, dupletos e abrí antes da leitura.As amostras experimentais garantem que a fluorescência estará na escala adequada. As microesferas não marcadas servem como controle negativo de fluorescência, e as partículas de calibração arco-íris ou RCPs podem ser usadas como controle positivo de fluorescência. Como as RCPs são menores que as microesferas CML, os parâmetros de dispersão frontal e dispersão lateral, bem como a posição no gate, podem precisar ser alterados temporariamente para essa amostra.Após essas calibrações, os extremos negativo e positivo da fluorescência são visualizados em um eixo logarítmico. Uma vez concluída a calibração com RCPs, retorne às configurações de microesferas não marcadas para dispersão direta e dispersão lateral. Desde que seja usado apenas um marcador fluorescente por amostra, como no experimento mostrado aqui, nenhuma compensação de fluorescência é necessária.Agora adquira e salve os arquivos de dados de fluorescência; a análise é realizada posteriormente usando software de citometria de fluxo, como Cell Quest ou FlowJo. Abaixo está o resultado de uma análise de citometria de fluxo com imunoprecipitação (IP FCM) de linfócitos T de camundongo LY em 1% de digitonina. O complexo proteico não ligado ao TCR CD3 foi precipitado com microesferas anti-CD3 épsilon.Os complexos capturados contêm quantidades significativas de TCR beta e CD3ε associado. Níveis próximos ao fundo de outras proteínas foram detectados, conforme determinado pelo uso de uma sonda de imunoglobulina irrelevante ou anticorpos contra as proteínas TH 1.2, CD 45 ou H 2 KD. As vantagens dessa técnica em comparação com outros métodos, como imunoprecipitação seguida de western blot, são a capacidade do I-P-F-C-M de permitir a avaliação de interações proteína-proteína nativas sem a necessidade de engenharia genética ou grandes tamanhos de amostra. O I-P-F-C-M pode gerar altas relações sinal-ruído mesmo quando há pouca biomaterial disponível para análise, pois pode ser realizado com pequenos volumes e baixas concentrações de analitos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos uma técnica baseada em citometria de fluxo para determinar a proporção de células T assassinas induzidas por citocinas, células CIK, expandidas a partir de uma cultura de células mononucleares de sangue periférico.

Reconhecimento de marcadores CD de células assassinas induzidas por citocinas humanas por citometria de fluxo

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular fornece um método quantitativo de alto rendimento para estudar a interação proteína-proteína. Esta metodologia pode ser aplicada ao mapeamento de locais de ligação de proteína e para o rastreio de factores que regulam a interacção proteína-proteína.

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína

Análise da interação de nanopartículas com subpopulações definidas de células do sistema imunológico, por citometria de fluxo.

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

A inflamação desempenha um papel central na patogênese do AVC isquêmico. Evidências crescentes sugerem que ele atua como uma faca de dois gumes que exacerba a lesão cerebral precoce, mas também contribui para o reparo posterior. Este protocolo descreve o isolamento de células imunes do cérebro isquêmico e sua subsequente fenotipagem citométrica de fluxo.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Este artigo descreve espectral citometria, uma nova abordagem em citometria de fluxo que usa as formas de espectros de emissão de distinguir fluorocromos. Um algoritmo substitui compensações e pode tratar auto-fluorescência como um parâmetro independente. Esta nova abordagem permite a análise adequada de células isoladas de órgãos sólidos.

Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

Um fluxo de ensaio de ligação celular baseados em citometria é descrito que é usado principalmente como uma ferramenta de triagem para identificar compostos que inibem a ligação de um ligante de chemokine CXC fluorescente etiquetada 12 (CXCL12) para o receptor do chemokine CXC 4 (CXCR4).

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para identificar compostos que interrompem a ligação do ligante de Chemokine fluorescente-etiquetadas CXC 12 a CXC Chemokine Receptor 4

Este artigo descreve um método para analisar o conteúdo da célula imune do tecido adiposo por isolamento de células do sistema imunológico de tecido adiposo e posterior análise utilizando a citometria de fluxo.

Caracterização de células imunes no tecido adiposo humano usando citometria de fluxo

Citometria de fluxo de imagem fornece uma abordagem ideal para detectar a alteração morfológica e funcional das células em níveis individuais e populacionais. Função endocítica interrompida para apresentação de antigénios de lipídios em células dendríticas humanas expostas ao poluente foi demonstrada com um combinado transcriptomic perfis de expressão genética e morfológica demonstração do tráfico de proteína.

Integrar a citometria de fluxo de imagem e Transcriptomic de criação de perfil para avaliar alterados CD1d endocítica tráfico

Este protocolo descreve um método de triagem de alto rendimento baseado em citometria de fluxo para identificar drogas de moléculas pequenas que inibem a ativação de integrinas β2 em neutrófilos humanos.

Uma Técnica de Alto Rendimento Baseada em Citometria de Fluxo para Triagem de Drogas Inibidoras de Integrinas

Este trabalho descreve um protocolo para quantificação de modificações globais de histonas utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada. O trabalho também contém o protocolo de isolamento da micróglia que foi utilizado para a coleta de dados.

Quantificação de modificações pós-traducionais globais de histona utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada de camundongos

Identificar micróglia (MG) e macrófagos infiltrantes periféricos (Mø) na medula espinhal lesada é difícil. Neste protocolo, a citometria de fluxo (FCM) foi usada para identificar MG semelhante a M1, MG semelhante a M2, Mø semelhante a M1 e Mø semelhante a M2, respectivamente. Essa tecnologia também pode ser aplicada a outras doenças do sistema nervoso central para entender o papel da MG e da Mø.

Identificação de micróglia e macrófagos infiltrantes periféricos na medula espinhal lesada usando citometria de fluxo

Aprenda a técnica IP-FCM para analisar interações proteína-proteína nativas usando citometria de fluxo. Este método permite detectar complexos proteicos com alta sensibilidade em amostras pequenas.

FCM-IP: Imunoprecipitação Detectado por citometria de fluxo

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