Name: Volume fixo ou de pressão fixa: um modelo murino de choque hemorrágico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 31 s
Description: Aprenda a induzir choque hemorrágico em camundongos por cateterização cirúrgica para estudar respostas imunológicas e função de órgãos pós-trauma. Este modelo permite monitoramento fisiológico controlado.

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Biologia financiamento Source / Número Molecular de choque hemorrágico GM053789

1. Instrumento e Preparação do campo cirúrgico: 1. Preparação instrumento. Todos os procedimentos cirúrgicos são realizados usando técnicas assépticas. Uma almofada cirúrgica azul e vestir campo estéril são utilizados. Todos os materiais e instrumentos são esterilizados antes do uso. 6-0, aplicadores com ponta de algodão, gazes, macho-macho de 3 vias torneiras, e os instrumentos são esterilizados em autoclave. Transdutores, PE-50 e PE-10 tubos são esterilizados por óxido de etileno. Todas as torneiras de 3 vias, seringas e agulhas estéreis são recebidos. 6-0 é cortado em pedaços de 1 polegada (6 peças / animal) e colocados em sacos de esterilização de pequeno porte. Cotonete aplicadores, praças gaze 4x4, e macho-macho de 3 vias torneiras são colocadas em qualquer pequeno ou médio porte e bolsas de esterilização autoclavado. Nossos instrumentos cirúrgicos são esterilizados em autoclave a cada noite. Eles são lavados após a cirurgia usando sabão antibacteriano e água da torneira. Eles são autorizados a seca em uma almofada cirúrgica limpa azul. Em seguida, são cuidadosamente colocadas em uma bolsa de esterilização e esterilizado para uso no dia seguinte. Desde os transdutores e tubos têm componentes de plástico, eles devem ser esterilizados com gás, ou seja, Óxido de Etileno. PE-10 tubo é cortado em pedaços de 5 polegadas e colocado em uma bolsa de esterilização de pequeno porte. PE-50 é cortado em tubos de 18 polegadas pedaços e colocados em uma bolsa de esterilização médio. 2. Campo cirúrgico. Para set-up do campo cirúrgico, primeiro, ligar o esterilizador quente talão para garantir que ele atinja a temperatura adequada-300-350 F ° antes de iniciar as cirurgias. Em seguida, avance para as próximas etapas, colocando cirúrgica almofadas azuis para baixo em um álcool limpou bancada. Um pad vai sob o microscópio eo outro vai para a almofada de aquecimento onde a circulação de analisadores BP estão localizados. Coloque um campo estéril de vestir mais dois blocos cirúrgicos azul. Encha uma bandeja de instrumentos de aço inoxidável 03/01 da maneira com álcool a 70%. Use o suficiente EtOH 70% para cobrir todos os instrumentos cirúrgicos. Use um curativo estéril campo separado e colocá-lo ao lado do microscópio. Coloque todos os instrumentos esterilizados, sutura, gaze, e cateteres neste campo estéril. Tenha cuidado ao abrir instrumentos esterilizados e sutura para não contaminá-los por tocá-los. O melhor é usar luvas estéreis quando se faz este procedimento de instalação. 2. Mecânica Set-up e Procedimentos: 1. Cateter Set-up. Para configurar o cateter perna direita murino utilizado para medir pressão arterial, primeiro, coloque luvas estéreis. Então pegue a PE-10 estéril tubo da bolsa autoclavado. Agarre o meio do tubo com o dedo indicador eo polegar deixando cerca de um centímetro entre eles. Estiramento desta seção do tubo um pouco para torná-lo mais fino de diâmetro para ajudar com a inserção do cateter. Após o alongamento do tubo cortado ao meio com uma tesoura esterilizada. O tubo de 5 polegadas deve agora ser dois pedaços de aproximadamente 2 ½ polegadas de comprimento. Certifique-se de bisel o fim esticada. * NÃO ângulo de borda chanfrada demais, pois isso pode aumentar as chances de sair do lúmen picando através da parte inferior da parede do vaso. Inserir uma agulha 30G na extremidade sem corte unstretched da tubulação. Obter uma seringa estéril 1cc e uma torneira de 3 vias. Use uma compressa com álcool para esterilizar a parte superior do frasco 10cc estéril contendo solução salina heparinizada (0,1 ml Heparin/9.9ml Saline). Encha a seringa com 0,6-0.7cc da solução de heparina. Coloque a agulha 30G e cateter para o final do 3-way que está diretamente em frente à final masculina. Preencha a torneira, agulha 30G, e PE-10 tubos com a solução de heparina. Certifique-se que para obter todas as bolhas de ar do sistema. A maneira mais eficaz para remover todas as bolhas de ar é usar a gravidade. Aponte a agulha em direção ao chão, deixando a tubulação para balançar a bancada. Dê o hub agulha um movimento dos dedos e as bolhas vão flutuar para o topo da solução de heparina. Remova a agulha 30G do 3-way e remover as bolhas. Retirar líquido na parte de trás de 3 vias com a seringa 1cc para remover quaisquer bolhas que estão presos no 3-way e recolocar o tubo para o 3-way. Cerca de 1cc da mistura deve permanecer dentro da seringa. O mouse irá receber cerca de 0.05cc desta mistura (como resultado da lavagem do cateter para manter a permeabilidade após a inserção) equivale a cerca de 1U heparina / mouse. Coloque este cateter preenchido no campo esterilizado vestir com os instrumentos cirúrgicos. Para configurar o cateter perna esquerda murino siga o mesmo procedimento como descrito acima, com exceção da torneira de 3 vias. A perna esquerda é usada para desenhar o sangue ea torneira de 3 vias não é necessária. Encha uma outra seringa estéril 1cc com 0,15 0.2cc da mistura salina heparinizada. Ligar a agulha 30G e PE-10 tubing diretamente para a seringa 1cc. Preencha este sistema de cateter perna esquerda com a solução. Remova as bolhas a partir deste sistema, também. Coloque o cateter preenchido no campo esterilizado vestir com os instrumentos esterilizados. 2. Transdutor de Set-up. Ligar um transdutor estéril para o digi-med BPA 400 analisador de acordo com as especificações micro-med. Adaptar uma torneira de 3 vias em ambos os lados do transdutor. Encher uma seringa 10cc com solução de Ringer Lactato (LR) e anexá-lo ao 3-way para o transdutor vai deitado na bancada. Inserir uma agulha 23G em ambas as extremidades do pedaço de precut esterilizado de 18 polegadas PE-50 tubos. Prenda uma extremidade do tubo PE-50 para o 3-way com a seringa de 10cc em anexo. Preencher o 3-way e PE-50 set-up com LR. Certifique-se que para obter todas as bolhas de ar do sistema como descrito na seção anterior. Recolocar o 3-way para o transdutor e encher o nd transdutor e 2 de 3 vias com LR. Por último, coloque o metal macho-macho torneira leur lock-à agulha 23G da tubagem PE-50 para fixação do cateter perna direita murino. * É fundamental que o fluido permanecer no transdutor, quando em operação. * Siga calibração e zero procedimentos de acordo com a Micro-med protocolo. 3. Procedimentos cirúrgicos e Experimental: 1. Procedimentos Cirúrgicos. Começar pela administração de uma injeção intraperitoneal de sódio Pentobarbitol (Nembutol) (70mg/kg @ diluição de 1:10). Este procedimento é realizado, primeiramente, escolher o mouse para cima de sua jaula usando a base (extremidade mais proximal) de sua cauda. Em seguida, coloque o animal em cima da gaiola enquanto ainda segurando sua cauda. Agarrar a nuca do pescoço do mouse com o polegar eo dedo médio de cada lado do mouse logo atrás da patas dianteiras. O dedo indicador é usado para puxar a pele na região da cabeça / pescoço em direção à nuca para imobilizar a cabeça. Cauda do rato é então envolto e realizada entre o dedo mindinho e do dedo anelar enquanto o dedo anelar é pressionado para a região lombar da coluna vertebral do rato. O mouse deve estar dormindo dentro de 5 minutos. Depois o animal é anestesiado lugar-los para a placa de metal cirúrgica em posição supina. A técnica de fita solta loop é usado para imobilizar os animais gravando suas extremidades. A técnica de laço solto implica simplesmente cortar tiras finas de fita e envolver a fita frouxamente em torno de cada um dos membros dianteiros inferior à pata e em torno de cada um dos membros posteriores inferior à pata. A fita é então preso de volta para si e os que sobraram de fita está conectada à placa. Isto permite que as extremidades dos camundongos a assumir uma posição anatômica mais natural. Áreas abdominal e inguinal do animal são, então, raspada usando Oster A5 tamanho clippers 40 blade. A gaze 4x4 é adocicada com betadine e da área cirúrgica é, então, limpou para a esterilidade. Após imobilização e esterilização, um cone de nariz com 1cc de isoflurano é colocado sobre o nariz do mouse por alguns segundos antes de fazer a incisão inicial. O cone do nariz consiste de um tubo cônico 50cc preenchido com gaze. Metade do fundo do tubo é cortado criando um espaço para o nariz do rato para descansar dentro sem contato. A tampa (fundo de um recipiente de armazenamento de tecido) é colocado no final da cônica 50cc para garantir os vapores isoflurano não escapam. Uma vez que o animal respirações começam a diminuir, uma incisão de 4 5 milímetros pequeno é feito na pele paralelo ao músculo oblíquo interna esquerda do abdômen e do músculo abdominal transverso esquerdo. Dissecção da veia femoral e da artéria segue. Certifique-se de não danificar os músculos que rodeiam ou nervos toque. Para começar essa dissecação, separar o tecido adiposo dos músculos oblíquos e transverso abdominal, agarrando o tecido adiposo com o dumonts na conexão abdominal. Puxe o tecido de distância da parede muscular. Então, blunt dissecar ao longo dos músculos abdominal provocando longe fáscia e tecido adiposo com o outro par de dumonts. Logo abaixo deste tecido adiposo mentira a veia femoral e da artéria junto com o nervo femoral. * Cuidado para não danificar o vasto intermédio, medial e lateral do músculo do quadríceps femoral ou o reto femoral. Não há realmente nenhuma necessidade de pegar ou mesmo tocar esses músculos. * Não toque o nervo femoral Dissecar o nervo fora, agarrando o tecido adiposo que se encontra ao lado dele. Puxe este tecido lateralmente da veia e artéria eo nervo seguirá como está incorporado neste tecido. Como o nervo é puxado lateralmente, blunt dissecar o fascia, colocando o dumonts, apontam para baixo, contra a artéria e abertura e fechamento delas. Os vasos são muito superficiais para ter certeza de nãoescavar os músculos subjacentes. Após o nervo é separado, use o dumonts para separar a fáscia segurando os vasos para os músculos. Manter o dumonts fechada e desliza o dorsal dumonts aos vasos. Como a ponta do dumonts aparece do outro lado da veia, abri-los para blunt dissecar a fáscia. Manter o dorsal dumonts ao navio e pegue a primeira sutura. Coloque a sutura no dumonts e puxe o fio para trás através da abertura feita entre os vasos e os músculos subjacentes. Novamente, não há necessidade de qualquer dano muscular circundante. Coloque um total de 3, 6-0 ao redor da veia e artéria. Sutura 1 é o mais proximal para os músculos abdominais. Dê um nó, mas deixá-lo solto e hemostat-lo. A borda côncava da hemostat deve descansar na cavidade abdominal do animal. Sutura 2 é o mais distal no local. Esta sutura pode ser amarrado imediatamente ligadura dos vasos e hemostated, mais uma vez o lado côncavo para baixo. As suturas proximal e distal são usados ​​para puxar as embarcações taut (para evitar a perda de sangue) e levantá-los um pouco para ajudar na inserção do cateter. Sutura 3 é uma sutura de suporte do cateter. Coloque este sutura entre as suturas proximal e distal. Dê um nó frouxo que vai ser usado para proteger o cateter dentro do vaso após a inserção. Após as suturas são seguras, identificar a artéria da parede do vaso de espessura. É muito branco. Fazer uma pequena incisão na parte superior da artéria usando o microtesoura. Faça um buraco perto da sutura distal para que haja uma ampla quantidade de artéria para a inserção do cateter inicial. Use o dumonts para abrir o buraco, colocando um fim do dumonts no lúmen do vaso arterial e fechá-los sobre a parede do vaso. Certifique-se a sutura proximal do meio é para o buraco arterial para que possa ser usada para manter o cateter no lugar após a inserção inicial. Enquanto segura a parede arterial empurrar o cateter no lúmen enquanto puxa a embarcação durante o cateter. Levemente amarrar a sutura de suporte do meio para manter o cateter no local. Solte o hemostat proximal. Esta versão vai soltar a sutura proximal e reabrir a sutura ao redor dos vasos. Neste ponto, a pressão arterial deve empurrar o sangue de volta para o cateter. Sangue pulsando deve ser visível no cateter. Manter os vasos ao redor do cateter com um dumont e usar as outras para empurrar o cateter dentro do vaso cerca de 4-5mm. Segurando o navio ao redor do cateter ajuda a prevenir a ruptura da artéria. A ponta do cateter deve descansar logo abaixo da musculatura abdominal oblíquo interno e transverso. Para a prevenção de coágulos sanguíneos na linha arterial, retirada de sangue no cateter e empurrá-lo de volta para o mouse várias vezes para infundir líquidos heparinizado. Repita este procedimento para a outra perna para canulação da artéria femoral bilateral. Gancho do animal até o monitor de parâmetros fisiológicos, ou seja, o analisador de BPA-400 e lave as linhas arterial. Coloque 1 ou 2 gotas de solução salina estéril para a abertura cirúrgica para manter a umidade do tecido circundante. Certifique-se de manter esta área saturada durante todo o procedimento. Coloque um campo estéril curativo sobre o animal durante todo o procedimento para ajudar a manter a esterilidade. Coloque instrumentos cirúrgicos em álcool 70% e limpe-os com gaze estéril. Colocá-los para dentro do esterilizador quente talão de ~ 20 segundos para esterilização entre os animais. Remover os instrumentos cirúrgicos e pulverizá-los com álcool 70% para ajudá-los a se refrescar. Coloque-os sobre o bloco estéril. Certifique-se que não há álcool deixou sobre os instrumentos que vai pingar de volta para os animais que vem. 2. Choque hemorrágico. Mais de um 15min. prazo, cerca de 1 / 2 do volume do rato o sangue é retirado atingir uma pressão arterial média de 28-32mm Hg. * Para um mouse de 25 27g o volume inicial de sangue retirado para alcançar a pressão desejada é de aproximadamente 0.6cc Este procedimento é um método de pressão fixos em oposição a um volume fixo. Esses procedimentos podem, no entanto, ser seguido tanto para pressão fixa e hemorragia volume fixo. Apesar de ser constantemente monitorado, o animal irá permanecer em estado de choque hemorrágico de 1,5 3 horas. Como o animal tenta compensar e da pressão arterial média começa a subir novamente ligeiramente (visível através do analisador de BP / HR) retirar mais sangue para alcançar a pressão desejada. Embora os suplementos (0.05cc IP Nembutol) são raramente necessárias durante o processo de HS, da respiração animal, movimento bigode, testes de reflexo, e os de leitura digital, BP / HR irá ajudar a determinar quando um animal precisa de um suplemento da anestesia. Animais são mantidos sob a lâmpada e uma almofada de aquecimento circulando para ajudar a manter uma temperatura de 36-37 ° C através do procedimento de choque hemorrágico. Temperatura é verificado através de uma sonda retal. 3. Ressuscitação. Após o tempo de choque Elapses, o animal é ressuscitado (R) com Lactato de Ringer (LR) solução a um volume fixo de 3x o volume de sangue de cada animal derramado. O volume LR é administrado através de um conjunto de bomba de seringa para dispensar, a uma taxa constante, o volume de mais de um 15min. intervalo. Remover o cateter e ligadura dos vasos usando os 3 suturas. Puxe o cateter apenas após a sutura proximal e gravata desta sutura completamente desligado. Isso vai evitar qualquer perda de sangue. Fluxo colateral impede a membros posteriores de se tornar isquêmico. 4. Pós Rescitation. Após R ambas as aberturas dos membros posteriores são costurados até usando sutura estéril PDSII 4-0. A fita de laço solto é removido e os animais são colocados em uma gaiola limpa, que é mantido em uma almofada de aquecimento circulando para recuperação de várias horas após. Analgésico deve ser administrado como os animais começam a acordar da anestesia para gerir adequadamente a dor. Buprenorfina (0.1mg/Kg) é injetado por via subcutânea, os animais começam a atividade física, mas não antes, de modo a não comprometer a função respiratória. Utilização da monitorização agressiva pós-operatório conforme garantido pelo IACUC protocolo aprovado, os comportamentos individuais dos animais, e as actuais condições médica é recomendada. 4. Segredos para o sucesso: <ol><li> Ao dissecar os vasos, não se esqueça de tocar o Nervo Femoral </li><li> Cuidado para não danificar o reto femoral, reto lateral, e os músculos vasto medial. Não há realmente nenhuma necessidade de pegar ou mesmo tocar esses músculos. </li><li> Não faça o ângulo do chanfro do cateter muito afiada como isso vai levar ao cateter sair do lúmen e hemorragia descontrolada </li><li> Certifique-se de fazer o esforço extra para permanecer tão estéril quanto possível. </li><li> Certifique-se que não há bolhas de ar em qualquer um dos sistemas de cateter ou transdutor. </li><li> Certifique-se de ter fluido LR em transdutor enquanto ele estiver em operação. A funcionar a seco pode danificar o seu sistema de PA. </li><li> Fazer o buraco arterial de pequeno porte. </li><li> Fazer o buraco arterial ao nível da sutura distal. </li><li> Empurre cateter, ao mesmo tempo puxando navio sobre ele para inserção de cateter para evitar que rasga a artéria. </li><li> Certifique-se de manter as aberturas cirúrgicas nas pernas saturada com solução salina estéril para evitar dano tecidual descontrolado ou perda de líquido. </li><li> Paciência e delicadeza são críticos. </li><li> Preste muita atenção para a fisiologia do animal durante o experimento. </li></ol> 5. Preocupações pós operativo: <ol><li> Verificar se há isquemia na perna. Embora o fluxo colateral deve evitar isso. </li><li> Animal pode ter problemas ao usar membros posteriores como resultado da manipulação cirúrgica e inflamação associadas. Controlar a dor de forma adequada. </li><li> Tocar e, posteriormente, danificando o nervo pode levar à incapacidade do animal de mobilização. </li></ol>

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Experimentos em animais foram supervisionados e realizados em conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Institutional Animal Care e do Comitê Use e realizar pesquisas e Compliance Office, da Universidade de Pittsburgh, um AALAS plenamente credenciado / instituição AALAC. Fontes animais incluem o Jackson Laboratories e Charles Rivers Laboratories. Todos os animais submetidos a garantia de saúde extensivo através de cada fornecedor, bem como a Universidade de Pittsburgh interna do animal programas de monitoramento de saúde. Esta pesquisa é conduzida em conformidade com os princípios do governo dos EUA para o uso de animais vertebrados. O programa está registrado com o USDA, e tem uma carta de garantia com o Gabinete de Serviço de Saúde Pública do Laboratório de Bem-Estar Animal.

<table border="1"><tbody><tr><th> Instrumento </th><th> Fabricante </th><th> Número Catálogo </th></tr><tr><td> Dumonts (SS/45 ° de ângulo de 0.2x0.12mm-ponta, comprimento 13,5 centímetros) </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11203-25 </td></tr><tr><td> Tesoura cirúrgica (straight-12cm) </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 14068-12 </td></tr><tr><td> Hemostats (curvo-12,5 centímetros) </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 13009-12 </td></tr><tr><td> Microtesoura (primavera oito centímetros tesoura reta) </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 15000-00 </td></tr><tr><td> Fórceps (0,8 milímetros de ponta, 10cm curva) </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11050-10 </td></tr><tr><td> sutura 6-0 reel </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 18020-60 </td></tr><tr><td> sutura PDSII 4-0 </td><td> Vet Penn </td><td> ETHZ304H </td></tr><tr><td> gaze 4x4 </td><td> podem ser adquiridos por meio de qualquer fornecedor mundial </td><td></td></tr><tr><td> cotonete aplicador </td><td> podem ser adquiridos por meio de qualquer fornecedor mundial </td><td></td></tr><tr><td> Agulha de 30G </td><td> podem ser adquiridos por meio de qualquer fornecedor mundial </td><td></td></tr><tr><td> Agulha de 23G </td><td> podem ser adquiridos por meio de qualquer fornecedor mundial </td><td></td></tr><tr><td> Seringa de 3cc </td><td> podem ser adquiridos por meio de qualquer fornecedor mundial </td><td></td></tr><tr><td> Seringa 5cc </td><td> podem ser adquiridos por meio de qualquer fornecedor mundial </td><td></td></tr><tr><td> Seringa de 10cc </td><td> podem ser adquiridos por meio de qualquer fornecedor mundial </td><td></td></tr><tr><td> Tubo cônico 50cc </td><td> podem ser adquiridos por meio de qualquer fornecedor mundial </td><td></td></tr><tr><td> 1cc agulha da seringa w / 25G </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826-88 </td></tr><tr><td> Tubo de polietileno de 10 100 `(PE-10) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-170-12P </td></tr><tr><td> Tubo de polietileno de 50 100 `(PE-50) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-170-12B </td></tr><tr><td> Torneira de 3 vias </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9779127 </td></tr><tr><td> almofada azul cirúrgica </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50-7105 </td></tr><tr><td> Estéril curativos Campo </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9517505 </td></tr><tr><td> rolos de fita 1 &quot; </td><td> Corporate Express </td><td> MMM26001 </td></tr><tr><td> reta lado largo potes boca (usado como tampão para o nariz cone) </td><td> VWR </td><td> 159000-058 </td></tr><tr><td> bandeja de aço inox 8 &quot;x 11&quot; </td><td> VWR </td><td> 62687-049 </td></tr><tr><td> macho-macho bloqueio leur 3 vias </td><td> VWR </td><td> 20068-909 </td></tr><tr><td> esterilização bolsa de 3 &quot;x8&quot; </td><td> VWR </td><td> 24008 </td></tr><tr><td> esterilização bolsa 5 &quot;x10&quot; </td><td> VWR </td><td> 24010 </td></tr><tr><td> Selvagens microscópio M650 ficar w / explosão </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Leica D IC câmera digital / imagem ao vivo </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Digi-Med BPA-400 analisador e integrador de sistemas </td><td> Micro-Med </td><td> SYS-400 </td></tr><tr><td> TXD-310 (Digi-Med Transducer) </td><td> Micro-Med </td><td> TXD-300 </td></tr><tr><td> Computador </td><td> Dell </td><td></td></tr><tr><td> Esterilizador instrumento Hot talão </td><td> VWR </td><td> 18000-45 </td></tr><tr><td> Oster A5 clippers w. lâmina de tamanho 40 </td><td> VWR </td><td> 10749-020 </td></tr><tr><td> circulando heating pad 18x26 </td><td> Harvard </td><td> py872-5272 </td></tr><tr><td> rectal termômetro </td><td> Kent Scientific </td><td> RET-3 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Concentração </th><th> Fabricante </th><th> Número Catálogo </th></tr><tr><td> Pentobarbital sódico (Solução de sódio Nembutol) </td><td> 70mg/kg </td><td> Ovação </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfina HCl </td><td> 0.1mg/Kg </td><td> Bedford Laboratories </td><td></td></tr><tr><td> Lactato de Ringer Injection 250cc saco IV </td><td> Baxter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aerrane (isoflurano) </td><td> 99,9% </td><td> NLS da Saúde Animal </td><td> 105996 </td></tr><tr><td> Heparina sódica </td><td> 1000U </td><td> Abraxis </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de sódio bacteriostático </td><td> 0,9% </td><td> Hospira </td><td></td></tr><tr><td> Álcool etílico </td><td> 70% </td><td> Fármaco-AAPER </td><td></td></tr><tr><td> Triadine iodopovidona (Betadine) </td><td></td><td> Descartáveis ​​tríade </td><td></td></tr></tbody></table>

volume fixo ou de pressão fixa: um modelo murino de choque hemorrágico

Fixed Volume or Fixed Pressure: A Murine Model of Hemorrhagic Shock

É de conhecimento comum que a perda de sangue severa e lesões traumáticas podem levar a uma cascata de eventos prejudiciais sinalização, muitas vezes resultando em mortalidade. 1, 2, 3, 4, 5 Estes eventos de sinalização também pode levar a sepse e / ou disfunção de múltiplos órgãos (MOD ). 6, 7, 8, 9 É fundamental então, para investigar as causas da supressão das funções imunológicas e prejudicial cascatas de sinalização a fim de desenvolver formas mais eficazes para ajudar os pacientes que sofrem de lesões traumáticas. 10 Este choque hemorrágico pressão fixa (HS) procedimento, embora tecnicamente difícil, é um excelente recurso para a investigação destas condições fisiopatológicas. 11, 12, 13 Avanços na avaliação de sistemas biológicos, ou seja, Biologia de Sistemas permitiram que a comunidade científica para entender melhor as complexas redes fisiológicas e padrões de comunicação celular. 14 choque hemorrágico tem provado ser uma ferramenta vital para desvendar esses padrões de comunicação celular como eles se relacionam com a função imunológica. 15, 16, 17, 18 Este procedimento pode ser dominado! Este procedimento também pode ser usado tanto como um volume fixo ou abordagem pressão fixa. Nós adaptamos esta técnica no modelo murino para reforçar a investigação em inata e adaptativa a função imunológica. 19, 20, 21 Devido ao seu pequeno tamanho HS em camundongos apresenta desafios únicos. No entanto, devido às muitas linhagens de camundongos disponíveis, esta espécie representa um recurso sem precedentes para o estudo das respostas biológicas. O modelo HS é um importante modelo para o estudo de padrões de comunicação celular e as respostas dos sistemas tais como sistemas de mediador hormonais e inflamatórias, e os sinais de perigo, ou seja, DAMP e upregulation PAMP, uma vez que provoca reações distintas que diferem de outras formas de choque. 22, 23 , 24, 25 O desenvolvimento de transgênicos cepas murino ea indução de agentes biológicos para inibir a sinalização específica apresentaram oportunidades valiosas para elucidar a nossa compreensão da cima e para baixo regulação da transdução de sinal depois de severa perda de sangue, ou seja, HS e trauma 26, 27 , 28, 29, 30. Existem métodos de reanimação numerosos (R) em associação com HS e trauma. 31, 32, 33, 34 Um método de ressuscitação fixo volume de solução de ringer com lactato apenas (LR), igual a três vezes o volume o sangue derramado, é utilizado neste modelo para estudar mecanismos endógenos, tais como lesões de órgãos remoto e inflamação sistêmica. 35, 36, 38 Este método de ressuscitação é provado ser eficaz na avaliação dos efeitos do trauma e HS 38, 39.

O modelo de choque hemorrágico tem sido um recurso confiável e reprodutível facilitar a identificação e compreensão de cascatas de sinalização associadas com inflamação e lesão de órgãos-final após o trauma. Este artigo fornece uma descrição passo-a-passo de aspectos cirúrgicos e mecânicas associadas com o procedimento de choque hemorrágico experimental em camundongos.

Volume fixo ou de pressão fixa: um modelo murino de choque hemorrágico

É de conhecimento comum que a perda sanguínea grave e a lesão traumática podem levar a uma cascata de eventos de sinalização prejudiciais, resultando frequentemente em mortalidade. 1, ...

Para caracterizar as respostas imunológicas ao choque hipovolêmico, realiza-se um procedimento cirúrgico no qual os vasos de um camundongo são dissecados e cateterizados. Enquanto se monitora a fisiologia do animal por meio de gravação digital e observação física, induz-se choque hemorrágico para simular uma experiência traumática após o choque induzido. O camundongo é reanimado, o cateter é removido e o animal é deixado em recuperação.O camundongo pode então ser estudado para avaliar alterações na função orgânica, nos padrões de comunicação celular e na expressão genética por meio de uma variedade de técnicas, como citometria de fluxo, hematologia, blotagens imunológicas, imuno-histoquímica ou microarranjos de chips genéticos. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que este modelo de choque hemorrágico com volume fixo ou pressão fixa permite ao pesquisador controlar o grau de choque enquanto monitora continuamente e registra com precisão as flutuações fisiológicas. Este método específico de choque hemorrágico aumenta a capacidade do pesquisador de estudar e compreender a função imunológica em preparação para a cirurgia.Certifique-se de que o seguinte equipamento e suprimentos estéreis estão disponíveis. Seis suturas zero, cotonetes, gaze, cânulas macho, cânulas macho, torneiras de três vias, transdutores, pedaços de 18 polegadas de tubo PE 50 e pedaços de cinco polegadas de tubo PE 10. Os instrumentos cirúrgicos necessários são torneiras de três vias, uma seringa de 1 cc, uma seringa de 10 cc, uma agulha de 23 gauge, uma agulha de 30,5 gauge, tesoura microcirúrgica, pinça fina, pacote cirúrgico, pinças, hemostáticos e tesoura cirúrgica.Suprimentos adicionais são solução de Ringer com lactato e álcool para preparo. Um suporte metálico, um campo estéril, luvas estéreis, Betadine, solução salina estéril, solução salina heparinizada e anestesia. No dia da cirurgia, prepare o cateter para a perna direita usado para medir a pressão arterial utilizando luvas estéreis.Com ambas as mãos, segure o centro de um pedaço de tubo PE 10 estéril de cinco polegadas e estique-o cerca de uma polegada para facilitar a inserção do cateter. Usando a tesoura estéril, corte o tubo ao meio, fazendo um bisel na extremidade esticada. Em seguida, insira uma agulha de calibre 30 na extremidade romba do tubo PE 10 não esticado.Usando um lenço umedecido com álcool, esterilize a parte superior de um frasco estéril de 10 cc contendo a solução salina heparinizada. Encha uma seringa de 1 cc com 0,6 a 0,7 centímetros cúbicos da solução de heparina. Fixe uma agulha de calibre 30 e um cateter à extremidade de uma torneira de três vias que esteja diretamente oposta à extremidade macho.Encha a agulha de cânula 30 com a solução de heparina e o tubo PE, certificando-se de que não haja bolhas de ar. Remova as bolhas de ar batendo levemente, em seguida, retire a agulha 30 da válvula de três vias e aspire o fluido presente na válvula de volta para a seringa de um CC para eliminar quaisquer bolhas aprisionadas na válvula de três vias, e depois reconecte a agulha com o tubo acoplado. Aproximadamente 0,1 centímetros cúbicos da mistura devem permanecer na seringa.Para configurar o cateter de miragem da perna esquerda, siga o procedimento descrito acima, omitindo a torneira de três vias. Primeiro, limpe o saco de ringer lactato com álcool. Em seguida, conecte um transdutor estéril a uma máquina de pressão arterial e frequência cardíaca de acordo com as especificações micro me.Em seguida, acople uma torneira de três vias em ambas as extremidades do transdutor e coloque-o horizontalmente sobre a bancada. Encha uma seringa de 10 cc com solução de ringer lactato e conecte-a à torneira de três vias. Insira uma agulha de calibre 23 em ambas as extremidades de um segmento estéril de 18 polegadas de tubo PE 50.Conecte uma extremidade do tubo de PE à torneira de três vias com a seringa de 10 cc acoplada. Em seguida, encha a torneira de três vias e o conjunto de PE 50 com solução de Ringer lactato. Certifique-se de remover todas as bolhas de ar, como anteriormente.Em seguida, reconecte o três vias ao transdutor e preencha-o. E conecte um segundo três vias com ringers lactato. Finalmente, acople a chave de passagem metálica macho-macho com trava de bloqueio à agulha de calibre 23 da tubulação de PE 50 para fixação ao cateter do membro inferior direito.Os instrumentos estão agora prontos para uso nos procedimentos cirúrgicos e experimentais para dissecção e cateterização dos vasos do camundongo, em preparação para a indução de choque. Comece colocando um camundongo anestesiado com pentobarbital de sódio sobre a placa cirúrgica de metal. Na posição supina, imobilize o animal por meio da técnica de fita com laço solto, que consiste em envolver levemente tiras finas de fita ao redor de cada membro abaixo do orifício e fixá-las na placa usando uma tesoura osteocrânica com lâmina tamanho 40, depile as regiões abdominais e inguinais do animal.Em seguida, usando gaze, limpe a área com Betadine e álcool para esterilizá-la. Coloque um cone nasal com um centímetro cúbico de fluoreto sobre o nariz do camundongo. Assim que a respiração do animal começar a desacelerar, teste a profundidade da anestesia utilizando o reflexo de retirada da extensão do membro.Coloque um curativo estéril sobre o animal durante todo o procedimento para ajudar a manter a esterilidade. Em seguida, faça uma pequena incisão de quatro a cinco milímetros na pele paralelamente ao músculo oblíquo interno esquerdo do abdômen e ao músculo transverso do abdômen esquerdo. Tendo o cuidado de não danificar os músculos circundantes nem tocar os nervos.Use o d&uacute;mon para segurar o tecido na conex&atilde;o abdominal e separar o tecido adiposo dos m&uacute;sculos obl&iacute;quo e transverso do abd&ocirc;men. Com o outro par de pin&ccedil;as de Allis, dissecar suavemente ao longo dos m&uacute;sculos abdominais, separando a f&aacute;scia e o tecido adiposo. Logo abaixo desse tecido adiposo, como na veia e art&eacute;ria femorais, juntamente com o nervo femoral sem toc&aacute;-lo, dissecar o nervo femoral segurando o tecido adiposo que se encontra ao lado dele.Puxe este tecido lateralmente a partir da veia e da artéria. O nervo que está embutido neste tecido seguirá conforme o nervo for puxado lateralmente. Coloque a outra ponta de Dumont voltada para baixo contra a artéria e abra e feche-as.Disseque a fáscia com a ponta romba. Os vasos são muito superficiais, portanto tenha cuidado para não penetrar nos músculos subjacentes. Após a separação do nervo, mantenha a pinça Dumont fechada e deslize-a dorsalmente aos vasos.Quando a ponta do dumont aparecer no outro lado da veia, abra-a para dissecar rombamente a fáscia. Mantenha o dumont dorsal ao vaso e segure a primeira sutura. Em seguida, puxe a sutura de volta através da abertura feita entre os vasos e os músculos subjacentes.Coloque um total de 360 pontos ao redor da sutura da veia e da artéria. Um deles é o mais próximo do nó no músculo abdominal; deixe-o frouxo e prenda-o com uma pinça hemostática. A borda côncava da pinça hemostática deve repousar sobre a cavidade abdominal do animal.O ponto dois está localizado mais distalmente. Amarre imediatamente esse ponto para ligar os vasos e prenda-o com uma pinça hemostática com o lado côncavo voltado para baixo; os pontos distal e proximal são usados para puxar os vasos firmemente, evitando perda sanguínea, e levantá-los um pouco para auxiliar na inserção do cateter. O ponto três deve ser colocado entre os pontos distal e proximal.Para suporte do cateter, faça um nó solto que será usado para fixar o cateter dentro do vaso após a inserção. Após os pontos estarem firmes, identifique a artéria pela parede espessa do vaso e pela cor branca. Usando a tesoura microcirúrgica, faça uma pequena incisão na parte superior da artéria, próxima ao ponto distal, de modo que haja uma quantidade suficiente de artéria para a inserção inicial do cateter.Coloque uma extremidade do dumont dentro da luz do vaso arterial e feche-as sobre a parede do vaso para abrir o orifício, segurando ao mesmo tempo a parede arterial. Insira o cateter na luz enquanto puxa o vaso sobre o cateter. Amarre levemente o ponto de sutura de suporte médio para manter o cateter no lugar.Em seguida, solte o hemostato proximal para afrouxar o ponto proximal e reabrir a sutura ao redor dos vasos. Nesse momento, a pressão arterial deve empurrar o sangue de volta para o cateter. Sangue pulsátil deve ser visível no cateter.Segure os vasos ao redor do cateter com uma mão e use a outra para empurrar o cateter para dentro do vaso. Quatro a cinco milímetros. A ponta do cateter deve repousar logo abaixo dos músculos oblíquo interno e transverso do abdome.Conecte o animal a um analisador BPA 400 e lave as linhas arteriais. Coloque uma ou duas gotas de solução salina estéril na abertura cirúrgica para manter o tecido circundante úmido durante os procedimentos de choque hemorrágico e ressuscitação para induzir o choque hemorrágico. Comece colocando o camundongo anestesiado sob uma lâmpada e sobre uma plataforma aquecida com circulação térmica para ajudar a manter a temperatura entre 36 e 37 graus Celsius.Em seguida, utilize uma seringa para retirar aproximadamente metade do volume sanguíneo do camundongo ao longo de um período de 15 minutos, a fim de atingir uma pressão arterial média entre 28 e 32 milímetros de mercúrio. Após 1,5 a três horas, reanime o animal utilizando uma bomba de infusão para administrar solução de Ringer lactato em volume três vezes maior que o volume perdido, a uma taxa constante durante 15 minutos. Após a reanimação do animal, remova o cateter e ligue os vasos.Usando três suturas, puxe o cateter logo após a sutura proximal, em seguida amarre completamente essa sutura para evitar perda sanguínea. O fluxo colateral impede que os membros posteriores fiquem isquêmicos. Por fim, feche ambas as aberturas dos membros posteriores com PDSI estéril quatro zero.Realizo a sutura. Remova a fita de laço solto e coloque o animal em uma gaiola limpa, que deve ser mantida sobre uma plataforma aquecida com circulação por várias horas. Pós-recuperação.Este diagrama representa uma visão geral do procedimento de choque hemorrágico. Após a cânulação bilateral e a conexão inicial ao monitor de pressão arterial, obtém-se cinco minutos de linha de base da pressão arterial. Uma vez registrada uma pressão arterial confiável, inicia-se a indução do choque, na qual o sangue é retirado pelo cateter femoral para atingir uma pressão arterial de 28 mais ou menos dois milímetros de mercúrio, devendo a retirada do sangue ocorrer ao longo de um período de 15 minutos.Após a indução do choque, ocorre um período de choque de duas horas e meia, no qual a pressão sanguínea é monitorada constantemente. Após o período de choque, realiza-se uma reanimação controlada utilizando uma bomba de seringa que infunde de volta no animal um volume três vezes maior que o volume de sangue drenado. Por fim, o animal é reconectado aos monitores de pressão sanguínea para obter uma nova avaliação basal.Isso ocorre por aproximadamente cinco a 10 minutos. Esta figura indica as respostas pró e anti-inflamatórias associadas ao choque hemorrágico. Ocorre uma tempestade de citocinas, na qual citocinas pró e anti-inflamatórias, juntamente com macrófagos, células T e uma infinidade de outras respostas fisiológicas, interagem em um circuito de feedback na tentativa de restabelecer o corpo às condições homeostáticas, reparando órgãos com deficiência de oxigênio.Esta representação gráfica indica a função hepática em camundongos selvagens submetidos a dois pontos temporais de choque hemorrágico em comparação com camundongos controle, o nível de alanina aminotransferase ou LT é mostrado no gráfico A e o nível de aspartato aminotransferase ou ST é mostrado no gráfico B. As enzimas hepáticas foram medidas utilizando um analisador de química sanguínea a partir do plasma sanguíneo. Essas imagens de microscopia de fluorescência mostram o tecido pulmonar em camundongos selvagens que foram submetidos a choque hemorrágico e controles.A coloração do Foid em uma actina é mostrada em verde e dappy. A coloração do núcleo é mostrada em azul. A expressão de iNOS é mostrada em vermelho, conforme pode ser visto aqui.Camundongos com choque hemorr&aacute;gico apresentam uma infiltra&ccedil;&atilde;o distinta de iNOS, mostrada em vermelho, no ep&eacute;lio br&ocirc;nquico e no endot&eacute;lio vascular do tecido pulmonar. Essa marca&ccedil;&atilde;o est&aacute; ausente em camundongos controle que passaram por um procedimento simulado. Essas microfotografias mostram se&ccedil;&otilde;es de tecido hep&aacute;tico de camundongos submetidos a choque hemorr&aacute;gico ou camundongos controle, fixados em paraformalde&iacute;do e corados com hematoxilina ou eosina.A seção de tecido dos camundongos submetidos a choque hemorrágico mostrou tecido necrótico como resultado da circulação e oxigenação reduzidas, o que não foi observado em camundongos que passaram pelo procedimento simulado. Ao tentar esta técnica, é muito importante lembrar-se de ser muito paciente e preciso com a técnica cirúrgica e a hemorragia. E tenha em mente que este modelo pode ser combinado com outros modelos traumáticos, como fratura bilateral do fêmur, fratura simulada e trauma de tecidos moles, a fim de responder perguntas relacionadas à imunologia de múltiplos traumas.

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