Name: Identificação de genes desregulados Induzida pelo Herpesvirus sarcoma de Kaposi-associado (KSHV) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprenda a técnica de dupla marcação por imunohistoquímica em tecido tumoral de sarcoma de Kaposi para identificar proteínas virais e celulares. Este método auxilia na localização de fatores celulares alterados pelo KSHV.

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Agradecemos a James EK Hildreth, Meharry Medical College, pelos seus conselhos e revisão do manuscrito. Agradecemos também a Diana Marver para a edição do manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Vanderbilt Meharry Center for AIDS Research (NIH conceder AI054999 P30-05), o Center for AIDS Research Disparidades de Saúde, NIH conceder 5U54 RR019192-05, o Centro de Pesquisa Clínica Meharry, NIH Grant P20RR011792, e pelo NIH conceder P01 CA113239. DJA foi parcialmente financiado por doações piloto do Centro de Vanderbilt-Meharry para AIDS Research (CFAR) e do Centro de Pesquisa Clínica Meharry (CRC).

<ol><li>Sitas, F., Newton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma in South Africa.</a> J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).</li>
<li>Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+PS+%22Field%27s+Virology%22">Field's Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).</li>
<li>Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li>
<li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).</li>
<li>Cesarman, E., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+a+lymphotropic+human+herpesvirus+associated+with+Kaposi%27s+sarcoma%2C+primary+effusion+lymphoma%2C+and+multicentric+Castleman%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Diagn+Pathol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi's sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman's disease.</a> Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).</li>
<li>Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+%28ORF74%29+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> J Virol. 76, 3421-3439 (2002).</li>
<li>Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+gene+expression+in+endothelial+%28spindle%29+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells.</a> J Virol. 71, 715-719 (1997).</li>
<li>Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+downregulation+of+galectin-3+in+kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi's sarcoma.</a> Glycobiology. , (2009).</li>
<li>Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+cell+conversion+by+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+formation+of+colonies+and+plaques+with+mixed+lytic+and+latent+gene+expression+in+infected+primary+dermal+microvascular+endothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures.</a> J Virol. 75, 5614-5626 (2001).</li>
<li>Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LANA-1%2C+Bcl-2%2C+Mcl-1+and+HIF-1alpha+protein+expression+in+HIV-associated+Kaposi+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma.</a> Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

As metodologias utilizadas neste relatório pode ser realizada em uma variedade de configurações de laboratório. Eles exigem algum equipamento especial ou acesso às instalações do núcleo. Precauções apropriadas devem ser tomadas ao fazer experimentos envolvendo patógenos virais infecciosas como KSHV que pode exigir a utilização de um nível de Biossegurança 3 (NB-3) instalações. Aquisições de tecido também deve ser aprovado pelo apropriado conselhos de revisão institucional (IRBs). Estas metod...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>05-0001DJ</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19364 (FLUKA)</td><td></td></tr><tr><td>Meio EBM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>+ suplemento do kit bullet</td></tr><tr><td>Células DMVEC (HMVEC)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC2543</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH30066.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas com câmara</td><td>Nalge Nunc international</td><td>154461</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal KSHV LANA</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-H913</td><td>1:50 diluição/IFA</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal de cabra anti-galectina-3</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF1154</td><td></td></tr><tr><td>Donkey-anti-goat FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-095-1</td><td></td></tr><tr><td>Donkey-anti-goat Rho</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-295-003</td><td>1:100 diluição/IFA</td></tr><tr><td>Meio de montagem</td><td>Vector Laboratories</td><td>H 1500</td><td>Vectashield com DAPI</td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína BCA</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocelulose</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0112</td><td></td></tr><tr><td>Conjugado de donkey-anti-goat</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC 2020</td><td></td></tr><tr><td>Substrato para Western</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-coelho-anti-cabra</td><td>Dako</td><td>305-065-045</td><td></td></tr><tr><td>Conjugado de estreptavidina-AP</td><td>Dako</td><td>K 0492 (kit)</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto RNase DNase Free</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Ciclador térmico MJ Mini</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-1148C</td><td></td></tr><tr><td>Biofotômetro</td><td>Eppendorf</td><td>952000006</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga RC 6 Plus</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Coulter Optima L-90K</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>392052</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de detecção em tempo real MYiQ iCycler PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9770</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente TE 2000S</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000S</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E 200</td><td>Nikon Instruments</td><td>E 200</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall Legend RT</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75004377</td><td></td></tr></tbody></table>

identificação de genes desregulados induzida pelo herpesvirus sarcoma de kaposi-associado (kshv)

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Atualmente KS é o mais predominante malignidade HIV / SIDA na África Austral e, consequentemente, do mundo. 1,2 Caracteriza-se como um tumor angioproliferativas de células endoteliais vasculares e produz raras doenças linfoproliferativas de células B na forma de linfomas derrame pleural (PEL) e algumas formas de doença multicêntrica de Castleman. 3-5% Somente 1-5 de células em lesões KS apoiar activamente a replicação lítica de sarcoma de Kaposi associado herpesvirus (KSHV), o agente etiológico associado com KS, e é claro que fatores celulares deve interagem com fatores viral no processo de oncogênese e progressão do tumor 6,7. Identificação de novas anfitrião fator determinantes que contribuem para KS patologia é essencial para o desenvolvimento de marcadores prognósticos para a progressão tumoral e metástases, bem como para o desenvolvimento de novas terapêuticas para o tratamento de KS 8. Os detalhes de vídeo que acompanha os métodos que usamos para identificar célula hospedeira programas de expressão gênica alterada em células endoteliais microvasculares dérmicas (DMVEC) após a infecção KSHV e em KS tecido tumoral. 9 Depois genes desregulados são identificadas por análise de microarray, mudanças na expressão de proteínas são confirmados por immunoblot e imunofluorescência rotulados dual. Mudanças na expressão transcricional de genes desregulados são confirmados in vitro quantitativa por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR). Validação dos resultados in vitro utilizando tecido tumoral de arquivamento KS também é realizada por imunoquímica rotulados dupla e microarrays do tecido. 8,10 Nossa abordagem para identificar genes desregulados no microambiente tecido tumoral KS permitirá o desenvolvimento de testes in vitro e posteriormente em sistemas modelo in vivo para descoberta e avaliação da terapêutica romance potencial para o tratamento do sarcoma de Kaposi.

Fatores da célula hospedeira desempenham um papel fundamental no estabelecimento e manutenção de sarcoma de Kaposi (KS). Esboçamos métodos para identificar os fatores da célula hospedeira alterado em células infectadas pelo KSHV DMVEC, e em KS tecido tumoral. Genes celulares alterados por vírus vai servir como potencial alvo (s) para novas terapêuticas.

Identificação de genes desregulados Induzida pelo Herpesvirus sarcoma de Kaposi-associado (KSHV)

Atualmente, o KS é a malignidade relacionada ao HIV/AIDS mais predominante na África Austral e, consequentemente, no mundo.1,2 Caracteriza-se como uma neoplasia angioproliferativa...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a marcação dupla de tecido tumoral de sarcoma de Kaposi por imuno-histoquímica para proteínas virais e de células hospedeiras. Isso é realizado primeiramente expondo os antígenos utilizando calor. O segundo passo do procedimento é a aplicação do anticorpo primário conjugado à biotina.O terceiro passo do procedimento é a adição do conjugado enzimático strep din. O passo final do procedimento é a adição do substrato enzimático ao tecido para desenvolvimento da coloração. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram a localização de proteínas virais e de células hospedeiras no tecido tumoral por meio da coloração imuno-histoquímica.Este método pode responder perguntas fundamentais na área de patologia, como a identificação de agentes infecciosos e de genes celulares desregulados no mesmo espécime. Sob uma capela de exaustão, coloque até oito lâminas Chem Eight com cortes de cinco micrômetros de tecido fixado em parafina em um frasco Coplin contendo xilol. Incube por 10 minutos para desparafinizar e preparar as lâminas para imunohistoquímica duplamente marcada.Reidrate o tecido em uma série de soluções de etanol a 100%, 95% e 70%, durante cinco minutos cada. Transfira as lâminas para água por pelo menos 10 minutos antes da desmascaramento antigênico, também conhecido como recuperação de antígeno para desmascaramento antigênico. Mergulhe as lâminas em um recipiente plástico contendo solução recém-preparada a 95 graus Celsius.Tamponar citrato 50 milimolar e aquecer em forno de micro-ondas para manter a fervura a 95 graus Celsius por 15 minutos. Transfira imediatamente as lâminas para um recipiente coplanar cheio de água destilada à temperatura ambiente. Transfira as lâminas para um frasco coplan limpo contendo solução de bloqueio recém-preparada.Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos para inibir a peroxidase endógena. Lavar três vezes com 1x PBS à temperatura ambiente, cinco minutos por lavagem. Remover as lâminas da lavagem com PBS e agitar para remover o excesso, cobrindo o tecido com 200 microlitros de solução bloqueadora gelada e, em seguida, cobrir com uma tira de parafina para evitar secagem.Coloque as lâminas em uma câmara umidificada e incube à temperatura ambiente por uma hora. Remova a tira de parafina e agite para remover o excesso de solução bloqueadora, adicionando 50 a 100 microlitros de anticorpo primário frio contra KSHV LANA diluído em tampão bloqueador para cobrir o tecido. Recoloque o tecido com uma tira fresca de parafina e incube na câmara umidificada por uma a duas horas.Lave as lâminas três vezes em PBS 1X durante cinco minutos. Em cada lavagem, adicione 50 a 100 microlitros de anticorpo secundário biotinilado diluído em PBS 1X e incube na câmara umedecida à temperatura ambiente por 30 a 45 minutos. Enquanto as lâminas estão em incubação, prepare a estreptavidina conjugada com peroxidase.Usando o kit de animação daco duet, adicione 10 microlitros da solução A a um mililitro de um XPBS em um tubo einor de 1,5 mililitro e vortex para homogeneizar. Adicione 10 microlitros da solução B e vortex novamente, incube à temperatura ambiente por 30 minutos. Lave as lâminas em um XPBS três vezes, durante cinco minutos cada lavagem.Como antes, adicione de 100 a 200 microlitros de estreptavidina conjugada à peroxidase do rábano-forrageiro aos lâminas. Incube em câmara umidificada à temperatura ambiente por 30 a 45 minutos. Novamente, lave os lâminas três vezes em PBS 1X durante cinco minutos por lavagem.Cinco minutos antes do final da etapa de lavagem, adicione um comprimido de DAB em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 20 mililitros de XPBS 1x e 25 microlitros de peróxido de hidrogênio a 3%. Filtre a solução de DAB através de um filtro de seringa de 0,45 micrômetros, trabalhando com uma lâmina por vez. Cubra o tecido com um mililitro da solução de DAB sob iluminação de campo claro em um microscópio óptico.Monitore o desenvolvimento da coloração para KSHV Lana em células infectadas até que o desenvolvimento da coloração desejado seja alcançado. Mergulhe as lâminas em água destilada por cinco minutos para interromper a reação em marcação dupla. Retome com a desmascaramento de antígenos em tampão citrato a 95 graus Celsius conforme descrito no texto acompanhante e proceda com a coloração.Usando o mesmo procedimento, monte o tecido com meio de montagem per mont e cubra com uma lamínula, observando a imagem em iluminação de campo claro. Muitas vezes é desejável enviar diversos espécimes individuais embutidos em blocos de parafina para serem perfurados e organizados em uma matriz de microarranjo de tecidos para posterior análise estatística aqui. As células marrons positivas para a proteína celular pcam um CD 31, indicadas com uma seta cinza, agrupam-se ao redor dos vasos sanguíneos.Células vermelhas positivas para a proteína viral. Células marcadas com setas pretas indicam células infectadas com o vírus do herpes associado ao sarcoma de Kaposi. Abaixo, uma ampliação de menor aumento mostra células marrons positivas para a proteína celular pcam.Um CD31 indicado com setas cinzas em uma região ao redor dos vasos sanguíneos. Células vermelhas positivas para a proteína viral. Células marcadas com uma seta preta indicam infecção pelo herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi.Aqui está uma biópsia de tecido tumoral de sarcoma de Kaposi em um microarranjo de tecido tumoral com células marrons positivas para a proteína viral. Lana indica células infectadas com o herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi e que mostram alguma formação de células fusiformes. Aqui está outra biópsia de tecido tumoral de sarcoma de Kaposi em um microarranjo de tecido tumoral com células marrons positivas para a proteína viral.Lana indica células infectadas com o vírus do herpes associado ao sarcoma de Kaposi com alto grau de formação de células fusiformes. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar imunohistoquímica com dupla marcação em tecido embutido em parafina e fixado em formalina. Durante a realização deste experimento, é muito importante observar o desenvolvimento da coloração ao microscópio e interromper a reação em água.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós descrevemos um protocolo para identificar papéis fundamentais de moléculas de sinalização de acolhimento na replicação lítica de um herpesvírus modelo, gama herpesvírus 68 (γHV68). Utilizando linhagens de camundongos geneticamente modificados e fibroblastos embrionárias para γHV68 replicação lítica, o protocolo permite tanto caracterização fenotípica e molecular de interrogatório vírus-hospedeiro interações em replicação lítica viral.

Dissecando interação hospedeiro-vírus em replicação lítica de um herpesvírus modelo

Um método de se observar as moléculas individuais de DNA em células vivas é descrito. A técnica baseia-se na ligação de uma proteína fluorescente etiquetado repressor lac para os locais de ligação para a engenharia de ADN de interesse. Este método pode ser adaptado para seguir muitas DNAs recombinantes em células vivas ao longo do tempo.

Monitorando a replicação plasmídeo em células vivas de mamíferos longo de múltiplas gerações por microscopia de fluorescência

Retrovírus humanos endógenos (HERV), que ocupam a 8% do genoma humano, manter reduzidas capacidades de codificação, mas a centenas de milhares de repetições terminais longas (LTRs). Um costume microarray Affymetrix foi desenhado para identificar indivíduo expressão HERV lugar e foi usado em tecidos de câncer de próstata como uma prova de conceito para futuros estudos clínicos.

Identificação baseada em Microarray de Individual HERV Loci Expressão: Aplicação a descoberta de biomarcadores em câncer de próstata

Nós descrevemos um protocolo para medir a produção de citocinas antiviral em camundongos infectados com um vírus do herpes modelo murino herpesvírus gama 68 (γ HV68) que está intimamente relacionada ao sarcoma-associado herpesvírus de Kaposi humana (SKHV) e vírus Epstein-Barr (EBV). Utilizando linhagens de camundongos geneticamente modificados e fibroblastos de rato embrionárias (MEFs), avaliou-se a produção de citocinas anti-viral in vivo e ex vivo. "Reconstituição" a expressão de componentes...

Dissecando imunitário inatas Sinalização em Evasion Viral da produção de citocinas

Foi estabelecido um protocolo de hibridização fluorescente in situ para a detecção de um genoma do vírus de ADN persistente nas secções de tecido de modelos animais. Este protocolo permite estudar processo de infecção por codetection do genoma viral, os seus produtos de ARN, e proteínas virais ou celulares no interior das células individuais.

A detecção do genoma e Transcrições de um vírus DNA persistente em tecidos neuronais por fluorescentes Em situ Hibridização Combinado com Imunocoloração

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor induzido por infecção pelo herpesvírus oncogênicos vírus humano herpesvírus-8/KS (HHV-8/KSHV). O modelo de cultura de células endoteliais descrito aqui é especialmente adequado para estudar os mecanismos pelos quais KSHV transforma células hospedeiras.

Um modelo In Vitro para o estudo transformação celular por Herpesvirus Sarcoma de Kaposi

Fábricas de transcriptional virais são estruturas discretas que são enriquecidas com celular RNA polimerase II para aumentar a transcrição do gene viral durante a reativação. Aqui, um método para localizar sites de ativamente transcrevendo cromatina viral em 3D espaço nuclear por uma combinação de hibridação de RNA de coloração e em situ de imunofluorescência é descrito.

Imagem latente funcional das fábricas de transcrição Viral usando microscopia de fluorescência 3D

Aqui descrevemos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para descobrir destinos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos, especificamente a terapia rhabodvirus e vaccinia vírus, mas pode ser facilmente adaptado para outros Oncolíticos plataformas de vírus ou para descobrir genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus em geral.

Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia

Nós descrevemos um protocolo que utiliza a hibridação in situ da fluorescência (peixes) para visualizar RNAs herpética múltiplas dentro das pilhas humanas liticamente contaminadas, na suspensão ou no aderente. Este protocolo inclui a quantificação da fluorescência produzindo uma relação Mimivírus e pode ser estendido para o visualização simultâneo do anfitrião e das proteínas virais com imunofluorescência (se).

Hibridação in situ da fluorescência quantitativa (peixes) e immunofluorescence (se) de produtos específicos do gene em pilhas KSHV-infectadas

Este protocolo descreve um sistema in vitro para modelar a infecção lítica de novo do herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi usando vírions derivados de BAC16. O método permite a investigação da replicação e disseminação viral precoce. A produção de vírus infecciosos é quantificada por ensaios de unidades infecciosas baseados em GFP e PCR em tempo real de genomas virais encapsulados.

Estabelecimento e quantificação da infecção lítica de novo pelo herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi livre de células

Aprenda a técnica de dupla marcação por imunohistoquímica em tecido tumoral de sarcoma de Kaposi para identificar proteínas virais e celulares. Este método auxilia na localização de fatores celulares alterados pelo KSHV.

Identificação de genes desregulados Induzida pelo Herpesvirus sarcoma de Kaposi-associado (KSHV)

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