Name: No Protocolo situ de asas da borboleta Pupal Usando Riboprobes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Aprenda hibridização in situ com ribosondas para analisar expressão gênica em asas pupais de Bicyclus anynana. Este protocolo otimizado permite estudar padrões temporais de mRNA em Lepidoptera.

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Agradecemos a Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche suporte técnico para ajudar na resolução deste protocolo. Agradecemos também a William Piel para aconselhamento sobre a edição do filme.

DIA 1 <ol><li> Prepare as seguintes soluções: <ul><li> PBS 10x </li><li> 1x PBS </li><li> 1x PBT </li><li> 2 O DDH <ul><li> Adicionar DEPC 0,1% para volume total e agitar soluções vigorosamente. </li><li> Autoclave. </li></ul></li><li> Fix paraformaldeído 4% - usando PBS-DEPC </li><li> Proteinase K solução - se precipitar está presente vortex, vigorosamente antes de retirar alíquota </li><li> Tampão de digestão Parar </li><li> Tampão Prehybridization </li><li> 50:50 PBT: Buffer Prehybridization </li><li> Tampão de hibridização <ul><li> Soluções devem ser mantidos RNase-free. Use um vidro-ware que foi cozido (4 horas a 250 ° C) ou de plástico descartáveis. Pipetas sorológicas são muito úteis para a fabricação de soluções </li></ul></li></ul></li><li> Dissecar as asas do tempo-encenado pupas em PBS </li><li> Mover as asas diretamente para Fix tampão em poços de 24 placa de cultura bem à temperatura ambiente </li><li> Fix discos por 2 horas </li><li> Lavar 5 x 5 minutos em PBT </li><li> Incubar as asas durante 3 minutos em solução de Proteinase K </li><li> Enxágüe 2 x em Tampão Parar Digestão </li><li> Lavar 5 x 5 minutos em PBT </li><li> Lave 2 x 5 minutos em 50:50 PBT: PHB </li><li> Lavar 1 x 10 minutos em PHB </li><li> Incubar em PHB pelo menos 1 hora a 55 ° C. </li><li> Calor desnaturam RNA sonda (20-50ng necessários por poço) (80 ° C por 5 minutos) e adicione a tampão de hibridação (100 l necessária por poço) </li><li> Adicionar sonda para os poços e incubar 48 horas a 55 ° C </li></ol> DIA 3 <ol><li> Lavar 4 x 5 minutos em 55 ° C PHB </li><li> Incubar durante a noite em PHB, a 55 ° C </li></ol> DIA 4 <ol><li> Prepare as seguintes soluções: <ul><li> Buffer do bloco de anticorpos </li></ul></li><li> Lavar 1 x 5 minutos em 50:50 PBT: PHB </li><li> Lavar 4 x 5 minutos em PBT </li><li> Asas incubar por 1 hora em buffer do bloco a 4 ° C </li><li> Incubar as asas em uma diluição 1:2000 do anticorpo anti-Dig overnight a 4 ° C </li></ol> DIA 5 <ol><li> Prepare seguintes soluções: <ul><li> Tampão de detecção </li></ul><ul><li> Solução em desenvolvimento - (embrulhe em papel alumínio) sensível à luz </li></ul></li><li> Lavar 3 x 5 minutos em PBT em temperatura ambiente </li><li> Lave 7 x 5 minutos em PBT </li><li> Enxágüe asas duas vezes em tampão de Detecção </li><li> Desenvolver asas em 1 ml de Desenvolvimento de Solução - tempo de desenvolvimento deve ser monitorada a cada vez - vezes em desenvolvimento podem mudar até mesmo quando se utiliza as mesmas sondas e solução em desenvolvimento - em geral, verificação após 5-10 minutos e depois aumentar os intervalos até durante a noite. Placa deve ser envolto em papel alumínio para evitar exposição à luz, quando não verificar amostras. </li><li> Enxágüe cinco vezes em Tampão parar de desenvolver </li><li> Monte asas. </li></ol>

<ol><li>Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+and+eyespot+determination+in+butterfly+wings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings.</a> Science. 265, 109-114 (1994).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+in+formamide+protects+RNA+from+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Solubilization in formamide protects RNA from degradation.</a> Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).</li>
<li>Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+a+hedgehog+regulatory+circuit+in+butterfly+eyespot+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution.</a> Science. 283, 532-534 (1999).</li>
<li>Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+transformation+of+the+butterfly+Bicyclus+anynana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+%28Suppl%29%22%5BJournal%5D)">Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana.</a> Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).</li>
<li>Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+insights+into+questions+of+lepidopteran+wing+pattern+homology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology.</a> BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).</li>
<li>Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+control+of+transgene+expresson+using+laser+induction+of+the+hsp70+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter.</a> BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).</li>
<li>Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+function+in+butterfly+wings+and+the+evolution+of+insect+wing+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns.</a> 9, 109-115 (1999).</li>
</ol>

Otimização dos protocolos existentes Em hibridizações in situ em discos asa larval foram realizados com sucesso usando os discos de borboletas Precis coenia (Carroll et al, 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. O protocolo atual foi adaptado de um protocolo detalhado disponíveis mediante solicitação por escrito do Laboratório Carroll para colorações asa larval. As mudanças que fizemos servem para acomodar as diferenças entre os tecidos asa de larva e pupa. Durante pupal dissecções asas posteriores, a membrana peripodial ...

<table><tbody><tr><td>Tampão de Fixação</td><td></td><td></td><td></td><td>4% Paraformaldeído em PBS</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td></td><td>0,1% Tween 20 em PBS</td></tr><tr><td>Solução de Proteinase K</td><td></td><td></td><td></td><td>2,5&amp;#109;g/ml de Proteinase K em PBT</td></tr><tr><td>Tampão de Parada da Digestão</td><td></td><td></td><td></td><td>2 mg/ml de glicina em PBT</td></tr><tr><td>Tampão de Pré-Hibridização</td><td></td><td></td><td></td><td>Para 50 ml de PHB: 12 ml de água tratada com DEPC + 25 ml de formamida + 12,5 ml de 20 x SSC + 50 µl de Tween 20 + 500 µl de esperma de salmão a 10 mg/ml (livre de RNase, desnaturado por calor antes da adição à solução).</td></tr><tr><td>Tampão de Hibridização</td><td></td><td></td><td></td><td>Adicionar glicogênio a 1 mg/ml ao tampão de pré-hibridização</td></tr><tr><td>Tampão de Bloqueio</td><td></td><td></td><td></td><td>50 mM Tris pH 6,8, 150 mM NaCl, 0,5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml de BSA</td></tr><tr><td>Anti-DIG</td><td>Ab</td><td>Roche Group</td><td>11 093 274 910</td><td>Conjugado com fosfatase alcalina</td></tr><tr><td>Conjunto de Tampões para Lavagem e Bloqueio com DIG</td><td></td><td>Roche Group</td><td>11 585 762 001</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Mount – Meio de Montagem Aquoso</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0612</td><td>Meio de Montagem</td></tr></tbody></table>

no protocolo situ de asas da borboleta pupal usando riboprobes

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

Apresentamos aqui, em formato de vídeo, um protocolo para a hibridizações in situ nas asas pupal do Bicyclus borboleta anynana usando riboprobes. Em hibridizações in situ, um dos pilares da biologia do desenvolvimento, são úteis para estudar os padrões espaciais e temporais da expressão gênica no desenvolvimento de tecidos ao nível da transcrição. Se os anticorpos que alvejam os produtos de proteína de transcrição de genes ainda não foram desenvolvidos, e / ou existem múltiplas cópias do gene de uma proteína específica no genoma que não podem ser diferenciados utilizando anticorpos disponíveis, em situs pode ser usado em seu lugar. Enquanto um in situ para discos asa larval tem sido disponibilizados para a comunidade de borboletas por vários anos, o atual protocolo foi optimizado para as asas maiores e mais frágeis pupal.

A fim de examinar a expressão gênica no tecido da asa pupal de Bicyclus anynana, apresentamos um protocolo otimizado para em hibridizações in situ usando riboprobes. Nós também fornecemos diretrizes para a otimização deste protocolo para o uso em asas pupal das espécies de Lepidoptera outros.

No Protocolo situ de asas da borboleta Pupal Usando Riboprobes

Apresentamos aqui, em formato de vídeo, um protocolo para hibridizações in situ em asas de pupas da borboleta Bicyclus anynana utilizando ribossondas. In situ ...

Este é um protocolo ceto para asas de borboleta na fase de pupa. Assim, começamos coletando pré-pupas da gaiola, colocando-as em uma bandeja e, em seguida, fotografando seus tempos exatos de PPU paciente por meio de fotografia de lapso de tempo. Isso nos permite realizar as colorações em momentos precisos após a pupação ocorrer.Isso é importante porque diferentes RNAs mensageiros para diferentes proteínas são expressos em momentos distintos após a fecundação. Aqui estamos dissecando as asas pupais em uma placa de Petri com base de silicone, e a parte importante é remover as asas e colocá-las na solução fixadora para que fiquem bem planas. Se não estiverem planas nesta etapa, nunca mais ficarão planas.Após o tempo adequado de fixação, removemos o tampão fixador e realizamos cinco lavagens. Com o PBT, a etapa de proteinase K é bastante crítica e é utilizada para permeabilizar os tecidos para que a sonda possa penetrar; ela deve ser interrompida no momento certo com essas enxágues e lavagens. O esperma de salmão atua como uma fonte barata de DNA para impedir que a sonda se ligue em todos os lugares.O esperma é um dos componentes do tampão de pré-hibridização. Aqui, estamos adicionando o esperma ao tampão de pré-hibridização e, em seguida, será preparada uma solução, que é esta solução P-B-T-P-H-B 1 50 50, metade PBT e metade tampão de pré-hibridização. Esta solução é usada como uma solução intermediária para transferir suavemente as asas da solução de PBT, onde estão imersas, para a solução de pré-hibridização.E então há uma etapa intermediária em que as asas permanecerão inicialmente nesta solução 50 50. Aqui, as asas são incubadas em PHP por 10 minutos e, novamente, em PHP por uma hora a 55 graus. Enquanto isso, vamos preparar o tampão de hibridização, que é apenas o tampão de pré-hibridização misturado com glicogênio.Aqui estamos adicionando glicogênio ao PHV para preparar uma pequena quantidade de tampão de hibridização; a esse tampão, vamos adicionar a sonda desnaturada. Assim, estamos aquecendo um bloco térmico e centrifugando a sonda que foi armazenada a menos 20 graus, transferindo apenas a quantidade correta de sonda para um tubo a ser desnaturado a 80 graus por cerca de cinco minutos. Aqui estamos desnaturando duas sondas simultaneamente; portanto, adicionamos o tampão de hibridização à sonda e, em seguida, adicionamos cem microlitros da mistura de sonda a cada poço.Para finalizar esta etapa, vamos cobrir todos os poços com perfil, pois as asas serão incubadas pelos próximos dois dias a 55 graus, e o parfum evita a evaporação. Após dois dias de incubação, a sonda é removida lavando-se as asas com PHP, e a última lavagem permanece nas asas por mais 12 a 24 horas. Finalmente, as asas são lavadas por meio de uma série de etapas para devolvê-las à solução PBT. Assim, novamente, usando a solução mista 50 50 entre as etapas.Nesta etapa, a solução bloqueadora de anticorpos é adicionada às asas e o anticorpo anti-dig conjugado à fosfatase alcalina é adicionado ao PBT para obter uma concentração de aproximadamente um para 2000. Cerca de 300 microlitros dessa solução de anticorpo serão adicionados a cada poço, e as asas serão então colocadas na geladeira para incubação com o anticorpo durante a noite. No dia seguinte, o anticorpo é removido realizando-se uma série de lavagens com PBT, e então as asas serão enxaguadas duas vezes no tampão de detecção à temperatura ambiente.Finalmente, adiciona-se um mililitro da solução reveladora a cada poço e as asas são rapidamente cobertas com papel alumínio. Após cerca de 10 minutos, verifica-se que as asas estão começando a ficar roxas, mas ainda estão um pouco claras. Assim, são cobertas novamente e, alguns minutos depois, verifica-se mais uma vez e observa-se que ficaram um pouco mais escuras.Observe que as asas incubadas em diferentes sondas pareceram escurecer em taxas ligeiramente diferentes, então decidimos cobri-las novamente e, finalmente, 20 minutos depois, decidimos interromper a reação com o tampão de parada do desenvolvimento. As asas agora estão prontas para serem montadas em uma lâmina; assim, adicionamos uma pequena gota de meio de montagem em uma lâmina identificada e transferimos as asas para a lâmina pegando-as com pinças e colocando-as sobre a gota. Remova quaisquer bolhas de ar, alinhe suavemente a asa e cubra-a com uma lamínula.Neste experimento, utilizamos a sonda que tem como alvo os transcritos do gene grail, e os observamos localizados no centro do futuro padrão IPO da borboleta cyclist anana durante as fases iniciais do desenvolvimento da asa pupal.

in-situ-protocol-for-butterfly-pupal-wings-using-riboprobes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Usando Monte Whole In situ Hibridação a ligação de Biologia Molecular e Organísmicos

Este protocolo de hibridização in situ em preparação inteira discute etapas críticas que garantem resultados de alta qualidade e reprodutíveis para estudos de expressão gênica em embriões de camundongo com idade entre E8,5 e E11,5 dias.

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Aqui, descrevemos uma produção eficiente de...

A High Throughput In situ Método de hibridização para caracterizar padrões de expressão de mRNA no Rato Fetal Trato urogenital inferior

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Este protocolo demonstra como Ensaio de Proximidade A ligadura pode ser utilizada para detectar em interacções proteína-proteína in situ na junção neuromuscular, de larvas de Drosophila. Com esta técnica, os discos grande e Hu-li Shao tai são apresentados para formar um complexo na região pós-sináptica, uma associação previamente identificado por meio de co-imunoprecipitação.

Detecção de In Situ Complexos proteína-proteína no Drosophila Larval Junção Neuromuscular Usando Proximity Ligation Assay

Nós descrevemos um monte de todo o processo de hibridação in situ multi-alvo cromogénico (MC-DESEJO) em embriões de Drosophila intactas permitindo a detecção simultânea e específica de três padrões de distribuição mRNA diferentes, contrastando precipitados de cor.

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização para Comparando Expressão Gênica em Domínios<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

A capacidade de detectar com precisão as transcrições ou proteínas em Drosophila tecidos é fundamental para estudar a sua abundância e relacionadas com o processo de desenvolvimento de localização. Aqui está a descrição de um procedimento simples para dissecar as asas pupal. Estas asas podem ser usadas como amostras em várias técnicas (imuno-histoquímica, ensaio PCR, etc.).

Um método rápido e eficiente para dissecar asas Pupal de Drosophila apropriado para Immunodetections ou ensaios PCR

Este manuscrito apresenta um método detalhado para a geração X-cromossomo braço sondas e realizando fluorescência situ hibridação in (peixe) para examinar o estado da irmã coesão cromátide em prometafase e metáfase prendi  Drosófila ovócitos. Este protocolo é apropriado para determinar se a coesão de braço meiótica é intacta ou interrompidos em diferentes genótipos.

Uso de hibridização in situ de fluorescência (FISH) para monitorar o estado da coesão do braço em oócitos de Drosophila na prometáfase e na metáfase I

Este protocolo descreve uma abordagem eficaz de hibridização in situ para detectar os níveis de expressão mRNA e padrões espaciais de genes-alvo em fluido coelomico Sipunculus nudus.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Aprenda hibridização in situ com ribosondas para analisar expressão gênica em asas pupais de Bicyclus anynana. Este protocolo otimizado permite estudar padrões temporais de mRNA em Lepidoptera.

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