Um método para isolamento de ilhotas murino e transplante renal subcapsular

O transplante de ilhós tem sido proposto como um tratamento potencial para o diabetes tipo um. No entanto, duas grandes limitações impedem que seja uma realidade clínica generalizada. Primeiro, é necessário um grande número de ilhós por destinatário.

Como os ilhós são obtidos de doadores de órgãos, o número de receptores em potencial é severamente limitado. O segundo transplante requer tratamento vitalício com imunossupressores fortes, o que coloca o paciente, especialmente a população pediátrica, em risco de malignidade, infecção e insuficiência renal. O transplante de ilhós sob a cápsula renal do camundongo é realizado para investigar estratégias para melhorar os resultados clínicos do transplante.

Ilhós isolados de camundongos doadores saudáveis divididos em grupos e preparados para transplante. Os ilhós são então transplantados para o espaço subcapsular do rim. Em camundongos receptores diabéticos, a função do enxerto de ilhós é avaliada pelo monitoramento dos níveis de glicose no sangue, que revelam que aproximadamente 250 a 350 ilhós restaurarão a glicemia u em um camundongo receptor de 20 gramas dentro de 24 horas após o transplante.

A demonstração visual deste método é crítica quanto às etapas de canulação. O ducto colédoco comum e a transferência dos ilhós para o espaço subcapsular do rim são difíceis de aprender. Essas etapas requerem a identificação das estruturas teciduais, mãos firmes e o uso de técnicas que minimizem os danos teciduais.

Coloque um camundongo sacrificado em decúbito dorsal sobre uma toalha de papel no escopo de dissecação e borrife o abdômen com etanol a 70%. Use uma tesoura para abrir o abdômen com uma incisão em V da região púbica para ambas as patas dianteiras. O mouse está abaixo do escopo de dissecação.

Posicione-o com a cabeça apontando para o observador. Localize a entrada duodenal do ducto colédoco com uma pinça hemostática, a abertura duodenal do ducto colédoco. O hemostático deve ser posicionado de forma que, quando comprimido, corra exatamente ao longo da borda do intestino pancreático.

Aqui, dois métodos para canular o ducto biliar serão demonstrados. O método da mão livre e o método do fórceps auxiliam no canulamento do ducto biliar. Usando o método da mão livre, puxe o hemostático preso no duodeno para longe da cabeça do camundongo em direção à cauda para que o ducto biliar comum fique esticado.

Há uma confluência no ducto biliar perto do fígado, onde a bile drenada da vesícula biliar e as enzimas do fígado se juntam Antes de entrar nos intestinos, puxe o ducto biliar para expor o interior da posição V. Uma agulha dobrada de calibre 27 presa a uma seringa de cinco mililitros para que a agulha deslize através do V e canule diretamente a parte inferior do duto. Deslize a agulha vários milímetros além da extremidade do chanfro para evitar o refluxo para o fígado e a vesícula biliar.

Assim que a canulação for bem-sucedida, perfunda o pâncreas dispensando dois mililitros de liase da seringa. Observe a expansão do pâncreas sobre o estômago como uma indicação de canulação ideal. Alternativamente, o ducto biliar pode ser canulado.

Usando o método do cisto do fórceps. Puxe o hemostático C preso no duodeno para longe da cabeça do camundongo em direção à cauda para que o ducto biliar comum se torne ilícito. Em seguida, usando uma agulha dobrada de calibre 27 presa a uma seringa de cinco mililitros, perfure a fáscia abaixo do ducto biliar comum perto do fígado.

Use a agulha para limpar a fáscia do duto com a agulha ainda no lugar. Coloque o hemostático no chão e pegue um par de pinças. Use um braço da pinça aberta para apoiar o ducto biliar onde a agulha limpou a fáscia enquanto puxa o ducto e a pinça para frente.

Deslize a agulha no duto usando a pinça como batente traseiro. Uma canulação bem-sucedida é indicada por uma expansão uniforme da região do pâncreas na parte superior do estômago. Uma vez que o pâncreas tenha sido perfundido, remova o hemostático do duodeno.

Em seguida, use a pinça para levantar o duodeno e use um segundo par de pinças para separar o pâncreas dos intestinos. Em seguida, puxe o pâncreas para fora da parte superior do estômago e do baço. Finalmente, retire o pâncreas do abdômen e corte-o das conexões restantes da fáscia com o intestino, estômago e baço.

Coloque o pâncreas em um tubo cônico de 50 mililitros e coloque-o no gelo. Incube o pâncreas a 37 graus Celsius de acordo com as instruções do protocolo escrito que o acompanha. Após a incubação, adicione 20 mililitros de meio aos tubos e dissocie o tecido agitando os tubos vigorosamente 40 vezes em 10 segundos.

Esta etapa é crítica para a recuperação ideal das violetas. As células de spin são 800 rotações por minuto. Resus gasta em 15 mililitros de mídia e condensa as amostras.

Despeje a pasta ressuspensa através de uma tela de arame de 0,419 milímetros e canalize-a para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Enxágüe o primeiro tubo com mais 10 mililitros de meio contendo 10% de soro bovino fetal e despeje-o através da pastilha de malha de arame as células por centrifugação reus, dobre o pellet em cinco mililitros de temperatura ambiente seu opaco 10 77. Em seguida, bata suavemente por vários segundos, adicione mais cinco mililitros de seu opaco ao redor do interior do tubo para lavar os ilhós da parede do tubo, pipetar lentamente para cobrir 10 mililitros de soro livre RPMI na lateral do tubo a uma taxa de um mililitro por 10 segundos.

Uma interface nítida deve ser evidente. Em seguida, gire as amostras em uma centrífuga de balde oscilante a 20 graus Celsius e 900 vezes a gravidade por 20 minutos com aceleração muito lenta e sem frenagem após a centrifugação, as ilhotas serão separadas das células exócrinas usando uma pipeta sorológica descartável de 10 mililitros. Transfira os ilhós da interface de mídia histo Paque para um novo tubo cônico de 50 mililitros.

Vários tubos podem ser agrupados neste ponto para remover os ilhós residuais, seus tubos de enchimento opacos com soro contendo meios e pellet as ilhotas centrifugando os tubos por dois minutos a 800 rotações por minuto. Em seguida, reus suspende as ilhotas em mídia fresca. Repita esta etapa pelo menos duas vezes. Reus.

Suspenda o palete em cinco mililitros de mídia. Coloque um filtro de células de náilon de 0,1 milímetro de cabeça para baixo em um tubo cônico de 15 mililitros. Pipete a pasta de células ressuspensas através dela para coletar os ilhós.

Em seguida, enxágue o tubo de 50 mililitros com mais seis mililitros de mídia e passe-o pelo filtro. Coloque uma gota de três mililitros de meio em uma placa de Petri de 10 centímetros. Inverta o filtro de células e mergulhe-o na gota de meio para coletar os ilhós, pipetar mais cinco a sete mililitros de meio de cultura através do filtro para a placa de Petri.

Para coletar quaisquer ilhós restantes do filtro sob uma objetiva de quatro vezes, pegue os ilhós individualmente com uma pipeta P 200 e transfira-os para um tubo de micro fuge de 1,5 mililitro. Essas imagens mostram ilhós isolados de camundongos C 57 pretos de 12 semanas de idade. A pureza e a qualidade dos ilhós podem ser estimadas microscopicamente após a conclusão do procedimento de isolamento.

Por exemplo, as duas imagens mostradas aqui mostram um campo representativo onde detritos e contaminação de células exócrinas estão presentes. Ao escolher ilhós para um experimento, evite escolher células exócrinas contaminantes ou ilhós que pareçam insalubres. Ilhós com centros necróticos não são saudáveis, como mostrado nesta figura, tirada 24 horas após o isolamento, os centros necróticos não serão visíveis imediatamente após o isolamento.

Os ilhós que são células descamantes são inevitáveis e podem ser usados no transplante de ilhós neste vídeo de lapso de tempo de 24 horas de ilhós. Imediatamente após o isolamento, centros necróticos se desenvolvem em muitos dos ilhós. Esses centros necróticos parecem ser expelidos do ilhó perto do final da gravação enquanto pegam ilhós.

Agrupe-os de forma que cada tubo tenha uma distribuição uniforme da qualidade e tamanho dos ilhós. Por exemplo, cada grupo de 15 ilhós pode conter quatro ilhós de tamanho grande, seis ilhós médios e cinco ilhós pequenos. Lugar. O tubo em ilhós de gelo pode ser usado imediatamente para transplante ou manipulado.

Antes de usar. Coloque uma ponta de carregamento de gel estéril na abertura de um tubo microfundido de 1,5 mililitro para que haja uma curva suave, que faz uma forma de U na extremidade estreita da ponta. Ambas as aberturas da ponta devem estar voltadas diretamente para cima fora do microtubo de lixo.

Remova cuidadosamente um tubo de ilhós do gelo. Certifique-se de que todos os ilhós se acomodaram na parte inferior do tubo. Usando uma pipeta P 200, colete suavemente os ilhós em um volume mínimo do fundo do tubo e transfira-os para a ponta curva preparada.

Depois que os ilhós sedimentarem, remova o máximo possível do meio da ponta aspirando o meio através da grande abertura da ponta de carregamento de gel do rolamento do ilhó com uma ponta de carregamento de gel nova conectada a uma pipeta P 200. Prenda a extremidade não chanfrada da tubulação à abertura estreita da ponta de carregamento de gel do rolamento da ilhota. Em seguida, prenda a ponta a uma pipeta P 200 e empurre suavemente as ilhotas para dentro da tubulação.

Em seguida, conecte a borda não chanfrada do tubo PE 50 à agulha de uma seringa Hamilton de 25 microlitros. Com o êmbolo retirado para pressionar o êmbolo da seringa até que os ilhós estejam a aproximadamente 0,5 centímetros de distância da abertura chanfrada. Deixe a seringa de lado para que os ilhós possam se acomodar em uma única massa perto da abertura chanfrada do tubo enquanto o rim está sendo preparado para receber os ilhós.

Prepare o local da cirurgia cortando o cabelo e esfregando a pele com Betadine alternando com álcool isopropílico a 70% três vezes. Comece o procedimento de transplante de ilhós realizando uma pinça no dedo do pé para confirmar a anestesia no camundongo receptor. Coloque a haste de uma haste de vidro diretamente abaixo do mouse e abaixo do rim perpendicular à medula espinhal.

Em seguida, localize o rim através da pele e coloque uma cortina cirúrgica estéril. Uma vez localizado o rim, use uma tesoura de banis McFerson para fazer uma incisão de dois centímetros através da derme diretamente acima dela, perpendicular à medula espinhal. Esta incisão irá expor a parede peritoneal com a tesoura.

Faça uma incisão de um centímetro através da parede peritoneal na mesma direção do corte através da camada dérmica usando a haste da haste de vidro como um recuo, force o rim através da abertura peritoneal pressionando a superfície adjacente. Molhe a superfície do rim exposto com PBS estéril e gelado usando um aplicador com ponta de algodão embebido. Repita a etapa a cada poucos minutos, conforme necessário, para evitar que a cápsula renal seque.

Usando uma agulha de calibre 27, faça uma incisão de 0,2 centímetro através da cápsula renal na superfície anterior do rim. Movendo-se do lado lateral esquerdo para o lado lateral direito, insira um tubo capilar de vidro puxado por chama. Sonde através da incisão feita anteriormente e mova-a na direção posterior ao longo da superfície lateral dorsal do rim.

Para criar uma bolsa entre a cápsula renal e o parênquima renal, mova os ilhós na seringa Hamilton de 25 mililitros preparada até a borda da abertura chanfrada do tubo flexível. Em seguida, insira a borda chanfrada voltada para cima na bolsa subcapsular. A borda longa está em contato com o parênquima renal.

Mova o tubo para a extremidade mais posterior da cápsula. Em seguida, transfira lentamente os ilhós do tubo PE 50 para a bolsa subcapsular, pressionando o êmbolo da seringa. À medida que os ilhós enchem a bolsa, recue lentamente o tubo flexível para abrir mais espaço.

Depois de remover o tubo da bolsa, deslize a sonda de vidro ao longo da superfície externa do rim de anterior a posterior para embalar suavemente os ilhós na extremidade proximal da bolsa. Usando uma pinça de braço dobrado, levante o revestimento peritoneal adjacente à abertura feita para o rim. Em seguida, use um aplicador com ponta de algodão embebido em PBS para empurrar suavemente o rim de volta para a cavidade peritoneal.

Feche o mouse aplicando suturas na parede peritoneal e enrole clipes na camada dérmica. Retorne o mouse para sua gaiola e monitore. Para recuperação, deve-se fornecer água aceto meine para o intestino do camundongo.

Ilhós do rato de C isolados. Usando os métodos descritos neste vídeo, uma dose curativa foi transplantada para C 57 alogênico de seis camundongos pretos. Os níveis de glicose no sangue sem jejum foram monitorados desde o primeiro dia de pós-operatório.

A rejeição pode ser observada por volta do dia 17 em camundongos receptores de 20 gramas que receberam 300 ilhós de um doador alogênico Aqui. A recuperação foi monitorada em camundongos que receberam 150 ilhós ou 300 ilhós de doadores singênicos. Nenhuma rejeição é observada nesses transplantes, pois os ilhós são de doadores singênicos.

A dose de ilhós administrada mede a função primária dos ilhós imediatamente após o transplante. Enquanto a recuperação marginal foi observada com 150 ilhós, a recuperação total foi observada quando 300 ilhós foram transplantados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como executar as etapas críticas necessárias para isolar ilhós de camundongo e transplantá-los sob o espaço subcapsular do rim.

Com a prática, você desenvolverá a capacidade de canular rapidamente o ducto biliar comum, que é a etapa mais difícil deste protocolo.