Expressão gênica baseada em sistema regulável por tet-on induzível in vivo: um sistema de expressão gênica induzido por tetraciclina para ativação da transcrição do gene alvo em modelo de camundongo

O sistema tetraciclina-On ou Tet-On é um sistema de expressão gênica condicional que ativa a expressão do gene de interesse na presença de tetraciclina ou seu análogo, a doxiciclina.

Comece com um camundongo geneticamente modificado com um genoma modificado contendo o gene que codifica a proteína ativadora transcricional controlada por tetraciclina reversa, ou rtTA, impulsionada por um promotor específico do fígado nas células do fígado ou hepatócitos. Além disso, o camundongo contém um gene de interesse sob o controle do operador de tetraciclina ou sequências tetO localizadas a montante e fundidas seletivamente a um promotor mínimo. O tetO e o promotor são chamados de elemento responsivo à tetraciclina, ou TRE.

A rtTA expressa - uma proteína de fusão que compreende o repressor tet, tetR e o domínio de transativação da proteína viral VP16 - forma dímeros, que são inativos e não podem se ligar à sequência tetO do TRE, impedindo a ativação da expressão do gene alvo.

Prepare uma solução contendo doxiciclina e sacarose. A adição de sacarose aumenta a palatabilidade. Após a filtragem, forneça a solução de doxiciclina-sacarose como água potável para o camundongo. A doxiciclina administrada se acumula no fígado.

Nos hepatócitos, a doxiciclina se liga ao rtTA, causando alteração conformacional e aumento da afinidade pelo local de ligação do DNA tetO. O domínio de ligação ao DNA tetR do rtTA ligado à doxiciclina se liga à sequência tetO do elemento TRE. O domínio VP16 recruta ainda mais a RNA polimerase, levando à transcrição, formação de mRNA e subsequente expressão do gene alvo repórter a jusante.