Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma maneira conveniente de controlar a expressão de canais iônicos em sistemas heterólogos, evitando complicações prolongadas de cultura de células. Assim, fornecendo uma maneira de controlar as condições entre os experimentos e gerar resultados mais replicáveis. Este método pode ajudar a facilitar a pesquisa no campo do canal iônico.

Como caracterizar as propriedades do canal na farmacologia. Uma vez que os métodos atuais são complexos ou mostram expressão proteica inconsistente. A principal vantagem dessa técnica é que podemos atingir níveis de expressão controlados de uma ampla variedade de proteínas adaptadas para experimentos individuais em um tempo relativamente curto.

Para iniciar este procedimento, transfira as células TREX 293 para uma placa de 12 poços preparada com 0,9 mililitros de DMEM completo por poço para gerar 50% de confluência. E incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora de CO2. Em seguida, prepare uma mistura de transfecção composta de DMEM, o gene de interesse, mostrado aqui, TRPV1, um plasmídeo inerte e o reagente de transfecção lipídica.

Para experimentos eletrofisiológicos, inclua EGFP no plasmídeo de expressão de mamíferos no coquetel de transfecção para visualizar as células que sofrem transfecção com sucesso. Incube a mistura de transfecção em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, transfecte as células pipetando a mistura de transfecção gota a gota nas células revestidas na placa de 12 poços.

Balance a placa vigorosamente para garantir a dispersão homogênea do DNA e do reagente de transfecção. Depois, incube as células transfectadas durante a noite a 27 graus Celsius. Na manhã seguinte, se estiver realizando eletrofisiologia, confirme se as células foram transfectadas com sucesso observando o sinal fluorescente do EGFP sob uma lâmpada UV.

Se estiver realizando eletrofisiologia, transfira as células da placa de 12 poços para lamínulas revestidas com PDL em 500 microlitros de DMEM completo. Se estiver realizando imagens de cálcio, localize aproximadamente 20.000 células em câmaras de imagem de cálcio revestidas com PDL. Neste procedimento, prepare uma solução estoque de doxiciclina a um miligrama por mililitro em água bidestilada

Proteja a solução estoque da luz a quatro graus Celsius por até três semanas. Para armazenamento de longo prazo, mantenha a solução estoque de doxiciclina a 20 graus Celsius negativos. Em seguida, prepare uma solução fresca de doxiciclina em DMEM completo.

E aquecê-lo a 37 graus Celsius. Para registros eletrofisiológicos, pipete 500 microlitros de solução de doxiciclina a dois microgramas por mililitro para cada poço para fazer uma concentração final de doxiciclina a um micrograma por mililitro. Para imagens de cálcio, adicione 100 microlitros de solução de doxiciclina a três microgramas por mililitro a cada poço para fazer uma concentração final de doxiciclina a um micrograma por mililitro.

Incube a amostra pelo tempo desejado para indução a 37 graus Celsius e cinco por cento de CO2. Para calibrar a expressão da proteína por meio de imagens de cálcio, prepare a solução de Ringer e aqueça-a a 37 graus Celsius. Para ajudar a dispersar os ésteres AM, um indicador de íons fluroescentes, como o Fura-2 em soluções aquiosas, prepara uma solução de F-127 não iônico em DMSO.

Aquecer a solução a 27 graus Celsius até que o F-127 não iónico esteja dissolvido. Em seguida, armazene a solução não iônica de F-127 em temperatura ambiente e aqueça-a a 37 graus Celsius novamente antes de usar. Depois disso, prepare uma solução de carregamento Fura-2 AM a partir da solução de Ringer, suplementada com dois a três micromolares Fura-2 AM, 02 miligramas por mililitro de F-127 não iônico e 10 milimolares de D-glicose.

Em seguida, aspire o meio das células nas câmaras e substitua-o pela solução de carregamento Fura-2 AM. Incube as células por 60 minutos em temperatura ambiente no escuro. Em seguida, aspire a solução Fura-2 AM.

E lave as células com solução de Ringer e D-glicose 10 milimolares para remover o corante extracelular. Deixe 200 microlitros de solução de Ringer e 10 milimolares de D-glicose em cada um. E incube-o por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro.

Após 30 minutos, coloque a câmara no stage acima da peça do nariz do microscópio e prenda-a com o suporte. Em seguida, calcule e prepare uma concentração de trabalho do agonista específico do TRPV1 capsaisina de acordo com a concentração final desejada. Em seguida, ligue a lâmpada, a câmera e o microscópio e selecione o filtro Fura-2 para detectar a emissão no comprimento de onda de 510 nanômetros.

Ajuste para a ampliação desejada e focalize as células no campo selecionado manipulando esses parâmetros usando os botões do microscópio. No escuro, subtraia a luz de fundo e defina o tempo de exposição. Defina a amostragem de imagem na taxa desejada.

Em seguida, comece registrando a resposta de fluorescência das células carregadas com Fura-2, excitando-as em comprimentos de onda de 340 nanômetros e 380 nanômetros. A proporção de 340 a 380 sinais é um indicador da concentração de cálcio intracelular e, portanto, também da atividade do TRPV1. Posteriormente, adicionar duas capsaicinas micromolares em 200 microlitros de solução de Ringer para criar uma concentração final de saturação de uma capsaicina micromolar a fim de avaliar o nível de expressão de TRPV1 e analisar a resposta do TRPV1.

Para determinar o tempo de indução ideal para gravação de canal único, primeiro prepare o banho e as soluções de pipeta. Em seguida, prepare algumas pipetas de vidro, polidas a fogo com uma resistência de 10 a 12 megaohms. Execute o patch clamp de célula inteira criando uma vedação na membrana da célula alvo.

Em seguida, defina o potencial de retenção para 40 milivolts negativos. E rompa a membrana aplicando pressão negativa. Em seguida, usando o micromanipulador, levante a pipeta com o adesivo de mebrana para longe da célula.

Em seguida, posicione o sistema de profusão diretamente ao lado da pipeta que contém o adesivo de membrana. Abaixe o filtro Bessel e o ganho de saída para dois a cinco killahurtz e 10 amperes, respectivamente. Em seguida, profunda as concentrações de saturação do agonista no adesivo de membrana.

Em seguida, analise o número de patches de canal único registrados com sucesso em relação ao tempo de indução aplicado às células e ajuste o tempo de indução de acordo com os resultados desejados. Aqui estão as imagens pseudocoloridas de células TREX 293 expressando transitoriamente RTRPV1, antes e depois da aplicação de capsaicina. E aqui estão as alterações correspondentes dos níveis de cálcio intracelular com o tempo nas células TREX 293 tratadas e transfectadas.

Cada gráfico representa uma média de 50 células. A taxa de sucesso do patch de canal único em gravações TRPV1 depende do tempo de indução. Aqui estão os traços atuais de adesivos de células TREX 293 expressando transitoriamente o RTRPV1 após duas horas e quatro horas de indução.

E este gráfico descreve o número de canais em um patch após o tempo indicado de indução. Esta técnica pode nos dar a análise de uma proteína com expressão controlada dentro de 12 horas após a transfecção, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de padronizar as concentrações de transfecção e o tempo de indução para diferentes proteínas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir um sistema de expressão controlável de maneira eficiente em termos de tempo para o íon de sua escolha.