Name: Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprenda a controlar a expressão de canais iônicos em sistemas heterólogos usando transfecção transiente com promotor induzível. Este método simplifica estudos de farmacologia e melhora a replicabilidade experimental.

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Este trabalho foi apoiado pelo Israel Science Foundation [Grants 1721/12, 1368/12 e 1444/16] (para o AP). AP é afiliado com Brettler Center e David R. Bloom Center, Escola de Farmácia, Universidade Hebraica de Jerusalém.

1. ligando o gene de interesse no site reprimível da Vector <ol><li> Obter um vector indutível, como pcDNA5 / FRT / TO ou pcDNA4 / TO. </li><li> Analisar o gene de interesse para quaisquer locais de restrição potencialmente sensíveis existentes no meio do gene que também estão presentes no local de clonagem múltiplo do vector escolhido por ADN em silico software de análise 4. </li><li> Utilizando técnicas de PCR padrão de sobreposição 4, flanquear o gene de interesse com dois locais de reconhecimento de enzimas de restrição seleccionadas (que não são encontrados no gene de interesse), o primeiro inserido antes do codão de iniciação, e o segundo após o codão de paragem. </li><li> Digerir tanto o vector e inserir com enzimas de restrição (seleccionadas no passo 1.2), à temperatura de trabalho dos enzimas durante uma hora, seguida pela adição de uma unidade de fosfatase de intestino de vitela (CIP) para a reacção apenas com vector durante 30 minutos a fim de evitar a auto- ligadura. </li><li>Carregar o ADN digerido num gel de agarose a 1% e separar os segmentos clivados por electroforese 9. </li><li> Usando luz UV, cortados com uma lâmina de os pedaços de gel contendo os desejados segmentos de vector e inserção ser ligado. </li><li> Extrair os segmentos de DNA a partir dos pedaços de gel de agarose (utilizando kits de extração de DNA comerciais disponíveis) e medir a sua concentração final em espectrofotômetro a 260 nm. </li><li> Ligar o gene de interesse no vector indutível seleccionado usando a enzima ligase de T4, à temperatura ambiente durante 20 minutos. A fim de aumentar a probabilidade de o inserto ligando com o vector, utilizar uma proporção de 3: 1 molar da inserção: vector. Para o controle, preparar uma reacção de ligação que inclui apenas o vector. </li><li> Para a transformação bacteriana, adicione 10 ng de vector sozinho e vector + gene em 50 mL E. coli competente. Incubar o tubo em gelo durante 30 minutos, seguido por 45 segundos de incubação a 42 ° C. Imediatamente coloque de voltaem gelo durante dois minutos e transferir as bactérias transformadas em meio de 500 mL de LB. Incubar durante uma hora a 37 ° C sob agitação a 220 rpm. </li><li> Para a selecção de bactérias transformadas com sucesso, a placa 100 uL de cada reacção (tal como descrito no ponto 1.9) numa placa de agar LB preparado contendo o antibiótico apropriado (por exemplo, 100 ug / mL de ampicilina ao usar pcDNA4 / TR). </li><li> Deixa-se crescer durante a noite a 37 ° C. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C durante até duas semanas por hermeticamente envolvendo-os em parafina filme plástico. </li><li> Elevador de colónias individuais usando uma ponta de 10 uL, e deixa-se crescer durante a noite em 3 mL de LB + meio antibiótico a 37 ° C sob agitação a 220 rpm. As bactérias com ADN de interesse podem ser congeladas (-20 ° C) durante o armazenamento a curto prazo, por centrifugação a LB e as bactérias a 11000 xg e o sobrenadante por aspiração para fora. O armazenamento a longo prazo, exige o congelamento das bactérias como estoques de glicerol a -80 ° C. </li><li> Extrair DNA through mini-prep e medir a concentração final em espectrofotômetro a 260 nm 5. </li><li> Confirmar inserção bem sucedida do gene de interesse por sequenciação da construção purificada 4. Alternativamente, a digestão de diagnóstico do construto por enzimas de restrição usando electroforese para separar os segmentos de corte e de avaliar a sua presença e comprimento também pode ser utilizado para este fim 4. </li></ol> 2. Linhas de Células que Expressam Cultivar TetR <ol><li> Obter uma linha de cultura de células albergando um plasmídeo do repressor Tet incorporado no seu ADN genómico. Aqui, o protocolo irá ser escrito usando células 293T de rim embrionário humano (HEK-293T) albergando o plasmídeo pcADN6 / TR, tal como um exemplo. </li><li> Semear as células em 100 milímetros placa de cultura de tecido com Dulbecco Modified Eagles Médium (DMEM) suplementado com 10% FBS, 1% de Penicilina-Estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, e 25 mM de HEPES, pH 7,3 (aqui: DMEM completo) e incubar ó / N a 37 &amp;# 176; C e 5% de CO 2. Todo o trabalho com células deve ser feito em uma capa biológica sob condições estéreis. </li><li> A fim de manter a expressão do gene repressor Tet, Aspirar o meio e substitui-lo com DMEM completo suplementado com 5 ng / mL de blasticidina. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Uma vez que as células atingem 80-90% de confluência, Aspirar o meio e suavemente lavar as células duas vezes com DPBS (sem cálcio e magnésio) aquecido a 37 ° C. </li><li> A fim de levantar suavemente as células sem causar danos mecânicos, incubar a cultura em DMEM contendo 0,05% de tripsina aquecida a 37 ° C durante 1,5 min. </li><li> Bloquear a acção da tripsina com um volume igual de DMEM completo. Pipeta suavemente para cima e para baixo, a fim de levantar as células e transferi-los para um tubo estéril. </li><li> Centrifugar as células a 200 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e substituí-lo por 1 mL completa DMEM. Pipetar a solução com as células para cima e para baixo até que nenhumaglomerados de células pode ser visto. Contagem e calcular o número de células utilizando um hemocitómetro. </li><li> Semente 1-2 x 10 6 células em placa de cultura de tecidos de 100 mm contendo 12 ml de DMEM completo com 5 ug / ml de blasticidina. Dividir as células duas vezes por semana como se atingir 90% de confluência. </li></ol> 3. transfecção do plasmídeo de interesse em células <ol><li> Usando o mesmo método de divisão de células, tal como descrito acima, as células de transferência para poços de uma placa de 12 poços preparado com 0,9 mL completo DMEM, suficiente para fazer 50% confluentes (~ 200000 células) e incubar durante a noite a 37 ° C num CO 2 incubadora. </li><li> Prepara-se uma mistura de transfecção com pcDNA4 / A contendo o gene de interesse, um plasmídeo inerte para levar a quantidade total de ADN a 1 jig (se necessário), 3 uL de reagente de transfecção de lípidos e DMEM para perfazer o volume final de 100 uL. A quantidade óptima de DNA de plasmídeo a ser usado varia amplamente como proteínas diferentes expressar na eficiência diferente. para eleitosexperimentos rophysiological, incluem EGFP no plasmídeo de expressão de mamífero no cocktail de transfecção, a fim de visualizar as células que sofrem transfecção com êxito 4. </li><li> Incubar a mistura de transfecção à TA durante 30 min. </li><li> Transfectar células pipetando a mistura de transfecção gota a gota sobre as células plaqueadas na placa de 12 poços e agitar a placa vigorosamente para assegurar uma dispersão homogénea de ADN e o reagente de transfecção. As células devem ser ~ 80% confluentes no momento da transfecção. </li><li> Incubar as células transfectadas O / N a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Confirmar que as células foram transfectadas com sucesso, observando o sinal de fluorescência de EGFP sob a lâmpada UV na manhã seguinte se realizar eletrofisiologia. </li></ol> 4. As células plaqueamento em Poli-D-lisina (PDL) Lamelas / Wells <ol><li> Esterilizar 12 mm lamelas por dousing com solução de etanol isopropílico a 70%. Seco e colocar um único coverslIP em cada poço de uma placa de 24 poços para o registo electrofisiológico. </li><li> Pipetar uma solução de 0,1-0,2 mg / ml solução em cada lamela PDL ou poço de uma câmara de imagem de cálcio. </li><li> Deixar assentar durante 30 min a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. </li><li> Lavar com grau de cultura de células de água bidestilada (DDW), três vezes, aspirando entre cada lavagem. Após a lavagem final, seque bem e deixe descansar em temperatura ambiente. </li><li> Para electrofisiologia, preencher cada uma das cavidades contendo uma lamela revestida PDL com 500 uL de DMEM completo aquecido a 37 ° C. </li><li> Realizar o mesmo método de separação das células transfectadas, tal como descrito acima. Após a ressuspensão das células após o tratamento com tripsina e de bloqueio, a transferência de 80 uL de células (ou aproximadamente 30000 células) para o centro de cada lamela revestida PDL para gravação electrofisiologia. Permitir que as células assentar durante pelo menos 1,5 hora ou a incubar durante a noite a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. </li><li> Para a transferência de imagem de cálcio e local 20 uL de células (cerca de 20000 células) para o centro de cada imagem de cálcio revestido PDL bem. Permitir que as células assentar durante pelo menos 30 min e adicionar 180 ul de DMEM completo a cada poço. </li></ol> 5. indução da expressão do gene <ol><li> Prepara-se uma solução estoque de doxiciclina de 1 mg / mL em DDW de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha a solução estoque protegida da luz a 4 ° C durante até 3 semanas. Para armazenamento a longo prazo manter solução de doxiciclina a -20 ° C. </li><li> Prepara-se uma fresco 2 ug / mL (electrofisiologia) ou / mL (imagem de cálcio) doxiciclina solução 3 ug em DMEM completo e aquecê-la a 37 ° C. </li><li> Para registos electrofisiolicos, pipeta 500 uL de 2 ug / mL de doxiciclina solução a cada poço para fazer uma concentração final de 1 ug / mL de doxiciclina. Para imagem de cálcio, adicionar 100 uL de solução / mL de doxiciclina 3 ug a cada poço para tornar um Concentra definitivação de 1 ug / mL de doxiciclina. Anote a hora da indução. </li><li> Incubar durante o período de tempo desejado para a indução a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 6. Calibração Timeline da expressão da proteína <ol><li> Calibrar a expressão da proteína através de Imagem de cálcio 5, 10 <ol><li> Preparar a solução de Ringer (NaCl 140 mM, KCl 2,5 mM, CaCl 2 1,8, 2 mM de MgSO4, 20 mM de HEPES, pH ajustado para 7,4 com NaOH) e aquecê-la a 37 ° C. </li><li> Prepare a concentrações saturantes de um agonista de canal em solução de Ringer. Uma vez que a quantidade de agonista é diluída quando adicionado às câmaras de imagem de cálcio, contendo as células e solução extracelular, o dobro da quantidade da concentração final desejada do agonista. Isto também faz com que a quantidade de solução de banho em cada poço crítico para controlar. </li><li> Prepara-se uma solução de n iico F-127 de 20% W / V em DMSO. Aquece-se a solução a 40 ° C até não iónico F-127 é dissolvido. Guardar a solução não iónico F-127 à TA e aquecê-la a 40 ° C antes da utilização. Não-iónico F-127 é utilizado para ajudar a dispersar os ésteres de acetoximetilo (AM) de indicadores de iões fluorescentes, tais como Fura-2 em soluções aquosas. </li><li> Aspirar o meio e substitui-la com uma solução de Fura-02:00 de carga (solução de Ringer suplementado com 2-3 | iM de Fura-02:00, 0,02 mg / mL não iónico F-127 e D-glicose 10 mM). </li><li> Incubar durante 60 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Aspirar Fura-2AM solução e lavar as células com uma solução de D-glicose de Ringer + 10 mM para remover o corante extracelular. Repita esta etapa duas vezes. </li><li> Deixar a solução D-glucose de 200 uL da campainha + 10 mM em cada poço e incubar durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Coloque câmara no palco acima da parte do nariz microscópio e prenda-o com o titular. </li><li> Acender a luz, câmera e microscópio e selecione filtro de Fura-2 para detectar emissão a 510 nm wavelength. </li><li> Ajustar para a ampliação desejada e se concentrar células no campo selecionado. </li><li> No escuro, subtrair a luz de fundo e definir o tempo de exposição. </li><li> Definir amostragem imagem na resposta da frequência e fluorescência registro desejado de Fura-2 células carregadas por eles emocionante a 340 e 380 comprimentos de onda nm. A proporção de 340/380 sinais é um indicador para a concentração intracelular de Ca2 + e assim também para a actividade de TRPV1. </li><li> Adicionar 2 uM capsaicina em solução de 200 ul da campainha por pipetagem para criar uma concentração de saturação final de 1 uM de capsaicina, a fim de avaliar o nível de expressão de TRPV1. </li><li> Analise resposta TRPV1 de acordo com o tempo de indução e determinar o protocolo para a proteína de interesse. </li></ol></li><li> Ajustando a expressão de proteínas heterólogas em sistemas utilizando a configuração de célula inteira da técnica de patch-clamp 4, 11. <ol><li> Prepare tele em banho de gelo de (mM) NaCl 140, KCl 2,3, MgSO4 2, 5 de HEPES, 5 e 2- (N-morfolino) etanossulfónico (MES), pH ajustado para 7,4 com NaOH. </li><li> Prepare a concentrações saturantes de um agonista de canal em solução extracelular. </li><li> Puxe eletrodos de vidro com um diâmetro interno (ID) de 1,10 mm e fogo-polonês para uma resistência de 2-4 mohms. </li><li> Prepara-se uma solução de pipeta (mM) 130 KCl, 4 NaCl, 2 MgSO4, 0,5 CaCl2, EGTA 1 e HEPES 10 ajustado para pH 7,2 com KOH. Filtra-se a solução da pipeta antes do uso. Antes de cada experiência, um único, pipeta de vidro polido ao fogo é preenchido por volta submergindo a ponta na solução da pipeta durante pelo menos um minuto, e, em seguida, preenchido usando ponta derretido e esticado com uma seringa cheia com a mesma solução de pipeta. </li><li> Suavemente levantar uma única lamela PDL revestido com as células plaqueadas do poço para uma placa de Petri de plástico 35 milímetros cheio com aproximadamente 2 mL de solução de banho à TA. Observar no âmbito de um epi-microscópio fluorescente. </li><li> Localizar uma célula positiva de EGFP, como visualizado com o microscópio de epifluorescência, sobre a lamela preparada e mover-se para o centro do campo visualizado. </li><li> Anexar a pipeta cheia ao titular da pipeta da micromanipulador, e injectar uma pequena quantidade de pressão positiva no sistema para evitar a contaminação da solução da pipeta intracelular. Abaixá-lo para um pouco acima da GFP - celular positiva, verificando a resistência adequada. </li><li> À medida que a pipeta toca a célula, aplicar uma pequena quantidade de pressão negativa, de modo a criar uma vedação entre o GÊ pipeta de vidro e a membrana celular. </li><li> Com um pulso curto, afiado de sucção, quebrar a membrana celular, permitindo que a pipeta para entrar em contacto com o conteúdo intracelular da célula. </li><li> Mude o modo de amplificador para células inteiras, e diminuir o ganho de filtro e saída de Bessel, 1 - 5 kHz e 0.5α, respectivamente. </li><li> Grave a resposta atual para o saturanteconcentrações de agonista dos canais usando rampas de tensão ou protocolo de livre lacuna. </li><li> Porque a eficiência de expressão alternar entre diferentes proteínas, repita as gravações usando diferentes tempos de comprimento indução. </li></ol></li><li> Determinar tempo de indução ideal para gravações de canal único 4. <ol><li> Prepara-se uma solução de (mM) 150 de Na-gluconato, 15 de NaCl, 5 EGTA, HEPES e 10, ajustado para pH 7,4 com NaOH, como uma solução pipeta. Para a solução do banho, usar a solução a partir do passo 6.2.1. </li><li> Repita o procedimento de células inteiras usando ID 0,86 mm pipetas de vidro fogo-polido para uma resistência de 10-12 mohms e definir potencial de realização de -40 mV. </li><li> Criar um selo sobre a membrana, tal como descrito anteriormente e a ruptura da membrana. </li><li> Usando o micromanipulador, levantar a pipeta com o remendo de membrana afastada, a partir da célula. </li><li> Posicione o sistema de perfusão ao lado da pipeta contendo o remendo de membrana. </li><li> Lower tele Bessel ganho de filtro e saída para 2-5 kHz e 10α, respectivamente. </li><li> Perfundir concentrações saturantes de um agonista para o remendo de membrana, avaliando se o adesivo contém um ou mais canais de acordo com a resposta. </li><li> Analisar o número de manchas único canal gravados com sucesso contra o tempo de indução aplicada às células. Ajustar o tempo de indução de acordo com os resultados desejados. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Transfecção é um protocolo amplamente utilizado para a expressão da proteína e da pesquisa, com muitas variações diferentes para melhorar a consistência e a estabilidade de expressão. reagentes de transfecção transitória oferecer um método simples, fácil de usar o protocolo em que a célula e a proteína de interesse pode ser analisado dentro de horas ou durante a noite a partir do momento da transfecção. Infelizmente, esta abordagem pode ser imprevisível quando o modo de análise requer um nível consistente de expressão d...

Sistemas de expressão heteróloga é uma das técnicas mais amplamente utilizado para estudar uma multiplicidade de funções celulares 1. Seu perfil baixo endógena de proteína, os requisitos mínimos de manutenção, o crescimento confiável e capacidade de assumir e expressar DNA estranho fizeram linhas celulares tais como embrionárias humanas de rim (HEK293) e ovário de hamster chinês (CHO) quase essencial para a pesquisa biológica 2, 3. Áreas de pesquisa usando sistemas heterólogos incluem proteínas de membrana, sinalização intracelular e atividade enzimática. A seguir à transfecção de ADN estranho na célula, muitas formas diferentes de análise pode ser realizada, incluindo a electrofisiologia, imagem de cálcio raciométrica, western blot, etc 4, 5. Devido à grande variedade de aplicações potenciais para sistemas de expressão heterólogos, muitos difereReagentes e produtos nt foram desenvolvidos para utilizar estas células e as suas qualidades 6. sistemas de entrega de DNA que transitoriamente ou permanentemente integrar DNA estranho em células para estudar proteína exógena tornou-se uma das ferramentas mais populares e úteis para a pesquisa biológica. Mais especificamente, a transfecção transiente de ADN para uma célula é amplamente usado como um processo para a frente simples, linear que requer relativamente pouco tempo e materiais. Além disso, a taxa de sucesso de células que sofrem transfecção é alta 7. Esta técnica é muito fiável quando combinado com um gene marcador tal como a proteína fluorescente verde (GFP), e pode ser usado para muitas técnicas diferentes, como a imagiologia de cálcio e electrofisiologia 5. Infelizmente, no entanto, que expressam transitoriamente o DNA em células hospedeiras vem com alguns dos principais armadilhas, não menos que o nível de expressão por célula não é fiável. O número de cópias do DNA de plasmídeo feita up por célula é incontrolável, assim, a expressão entre experiências individuais podem variar muito 2. Esta questão torna-se significativo quando quer tentar replicar condições fisiológicas, ou a realização de técnicas precisas de coleta de dados. Como uma solução para as complicações acima mencionadas, os protocolos de transfecção estável foram concebidos em que um gene de interesse pode ser inserido no genoma de uma célula sob o controlo apertado de um promotor indutível, tal como um sistema de tetraciclina repressor expressão, assegurando uma única cópia do plasmídeo se integra no genoma de cada célula e só é expressa após a indução do mecanismo de transcrição, por exemplo, na presença de doxiciclina. Enquanto isso resolve os obstáculos de níveis de expressão de proteína inconsistentes, este método perde a conveniência de protocolo rápido e relativamente simples de transfecções transitórias. O estabelecimento de uma linha de células estável leva pelo menos algumas semanas em which uma necessário calibrar uma curva de morte definido por antibióticos específicos para manter a expressão da proteína e assegurar a integração do vector e habilmente seleccionar e fazer crescer colónias de células. No geral, isto leva muito mais tempo e esforço com uma menor taxa de sucesso 8. Aqui, apresentamos um protocolo intermediário que tem por base os pontos fortes de ambas as opções de transfecção populares para fornecer uma maneira simples e eficaz para controlar os níveis de expressão em qualquer linha de células inducible. Enquanto se mantém as células com um sistema tet indutível, que transientemente transfectar nosso gene de interesse, transiente do receptor potencial canal de catião membro da subfamília V 1 (TRPV1), ligado a um vector que pode homologamente combinar com o sistema de repressor. Deste modo, o gene pode ser introduzido nas células sem começando a expressar. Apenas com a adição de doxiciclina não o gene começam a expressar, o que nos permite calibrar os níveis de proteína exprESSÃO de acordo com a técnica ou níveis observados em condições fisiológicas. Nosso protocolo também evita complicações associadas à geração de longas uma linha celular que expressa de forma estável. Começamos mostrando alteração dos níveis de ativação de TRPV1 na imagem de cálcio a partir de-un induzida através de quatro horas de indução e como o aumento dos níveis de cálcio intracelular está correlacionado. Em seguida, duplicar o protocolo em toda a configuração da célula da técnica de patch-clamp, mostrando o aumento da corrente com o tempo de indução a aumentar. Por fim, apresentamos exemplos de gravações de eletrofisiologia único canal, e mostrar que esta técnica é especialmente útil para a expressão controlada quando se olha para a coleta de dados precisos com base em unidades individuais da proteína. Através do nosso protocolo, que oferecem um modo conveniente de controlar a expressão de proteínas em sistemas heterólogos, evitando longas complicações de cultura de células, proporcionando assim uma maneira de controlar as condições de entre experiências e fornecer MOre resultados replicáveis.

<table><tbody><tr><td>pcDNA&trade; 4/TO Vetor de Expressão de Mamíferos</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102020</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA&trade; 5/TO Vetor de Expressão de Mamíferos</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V103320</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick PCR Purification Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K310001</td><td></td></tr><tr><td>Swift&trade; &nbsp; Termociclador MaxPro</td><td>Esco&nbsp;</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Enzimas de Restrição</td><td>ThermoScientific</td><td>Fisher ER0501</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Kit de Extração Rápida de Gel Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PureLink</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>One Shot&reg; TOP10 Quimicamente Competente E. coli</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>C404006&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina (Sódio), Grau USP</td><td>Gold Bio</td><td>A-301-5</td><td></td></tr><tr><td>Triptona para microbiologia</td><td>Merck</td><td>6.19305E+13</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de Levedura</td><td>BD worldwide</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>SIF6000R Incubated Shaker</td><td>LAB COMPANION</td><td>45H118</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin&reg; plasmídeo</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>MS Fonte de Alimentação 300V</td><td>Major Science</td><td>MP-300V</td><td></td></tr><tr><td>Owl&trade; EasyCast&trade; Sistema de Eletroforese em Gel Mini B1A</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>T-REx&trade;-293 linha celular</td><td>Invitrogen</td><td>R710-07</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x), líquido (glicose alta)</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF&reg;</td><td>NEB</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>ApaI</td><td>NEB</td><td>R0114S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart&reg; Tampão</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA&trade; 6/TR&nbsp; Vetor de Expressão de Mamíferos</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102520</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino (FBS), qualificado, aprovado pela UE, origem da América do Sul</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Penicilina-Estreptomicina</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanil-L-Glutamina (Estável Glutamina) (200 mM)</td><td>Biological Industries</td><td>03-022-1B</td><td></td></tr><tr><td>Heracell&trade; 150i CO2 Incubadora</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>51026406</td><td></td></tr><tr><td>MSC-Advantage&trade; Gabinete de Segurança Biológica Classe II</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>51025411</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Blasticidina S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (DPBS) Modificada, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetro metalizado duplo com regras de Neubauer</td><td>Hausser Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Meio de soro reduzido</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TransIT&reg;- Reagente de Transfecção LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas, espessura #1, diâmetro redondo de 12 mm</td><td>Vidro Knittel</td><td>GG-12</td><td></td></tr><tr><td>BioCoat&trade; Poli-D-Lisina (PDL)</td><td>Corning</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>Água, Grau de Cultura de Células Biological</td><td>Industries</td><td>03-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina hiclato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM éster</td><td>Biotium</td><td>BTM-50034</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&reg; F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 Well</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>(E)-Capsaicina</td><td>Tocris</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Fluorescência Olympus IX70</td><td>Olympus</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4 Wavelength Switcher</td><td>Sutter Instruments</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>EXi Câmera de Microscopia de Fluorescência Azul</td><td>QImaging</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>MetaFluorence Ratio Imaging Software</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de borosilicato de parede fina</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-110-7.5HP</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de borosilicato de parede padrão</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-7.5HP</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>P1000 extrator de micropipetas</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>MF-900 Microforge</td><td>NARISHIGE</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusão ValveBank</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata&reg; 1440A Sistema de Aquisição de Dados de Baixo Ruído</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos</td><td>moleculares</td> MP-225 de Sutter dos dispositivos moleculares do software do pCLAMP 10,6 <td>n.a</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

controlável expressão ion canal através de transfecção transiente induzível

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

A transfecção, a entrega de ácidos nucleicos estranhos numa célula, é uma ferramenta poderosa na pesquisa de proteínas. Através deste método, os canais iónicos pode ser investigada através de análise electrofisiológica, caracterização bioquímica, estudos mutacionais, e os seus efeitos sobre os processos celulares. As transfecções transientes oferecer um protocolo simples, em que a proteína se torna disponível para análise em poucas horas ou dias. Embora este método apresenta um protocolo de tempo relativamente simples e eficiente, um dos componentes críticos é calibrar a expressão do gene de interesse a níveis fisiológicos relevantes ou níveis que são adequados para análise. Para este fim, muitas abordagens diferentes, que oferecem a capacidade de controlar a expressão do gene de interesse têm surgido. Vários protocolos de transfecção de células estáveis ​​fornecem uma maneira de introduzir de forma permanente um gene de interesse no genoma celular sob a regulação de um transcrip controlado por tetraciclinaactivação cional. Embora essa técnica produz níveis de expressão de confiança, cada gene de interesse requer algumas semanas de trabalho qualificado, nomeadamente calibração de uma curva de morte, seleção de colônias de células e, em geral mais recursos. Aqui apresenta-se um protocolo que utiliza a transfecção transitória do canal de catiões Potencial membro da subfamília V um gene transiente do receptor (TRPV1) num sistema indutível de uma maneira eficiente para expressar uma proteína de uma forma controlada que é essencial na análise de canal iónico. Nós demonstramos que usando esta técnica, somos capazes de realizar imagem de cálcio, células inteiras, e análise único canal com os níveis dos canais controlados necessários para cada tipo de coleta de dados com uma única transfecção. No geral, esta técnica fornece uma replicáveis ​​que podem ser usadas para estudar a estrutura e função de canais iónicos.

Para criar rapidamente um modelo de expressão indutível, que feita utilização de células HEK293 que expressam a proteína Tetraciclina repressor (TR) (por exemplo, T-REX-293) e vectores que contêm sequências do operador de tetraciclina (TetO) entre o promotor CMV e o local de clonagem múltipla (por exemplo, pcDNA4 / A). Quando transfectado em células TRex-293, a expressão do gene de interesse em pcDNA4 / A é reprimida, tal como a TR liga TetO. A adição de doxiciclina ao ...

Estudar canais iônicos através de um sistema heterólogo expressar tornou-se uma técnica nuclear em pesquisa biomédica. Neste texto, apresentamos um método eficiente tempo para conseguir uma expressão de canal iónico com força controlada através da realização de transfecção transiente, sob o controlo de um promotor indutível.

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma maneira conveniente de controlar a expressão de canais iônicos em sistemas heterólogos, evitando complicações demoradas de cultivo celular. Assim, oferecendo um meio de controlar as condições entre experimentos e gerar resultados mais replicáveis. Este método pode ajudar a facilitar a pesquisa na área de canais iônicos.Como caracterizar as propriedades dos canais na farmacologia. Uma vez que os métodos atuais são complexos ou apresentam expressão proteica inconsistente. A principal vantagem desta técnica é que podemos alcançar níveis controlados de expressão de uma grande variedade de proteínas adaptadas para experimentos individuais em um tempo relativamente curto.Para iniciar este procedimento, transfira as células TREX 293 para uma placa de 12 poços preparada com 0,9 mililitros de DMEM completo por poço para atingir 50 por cento de confluência. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius em um incubador de CO2. Em seguida, prepare uma mistura de transfeção composta por DMEM, o gene de interesse, mostrado aqui como TRPV1, um plasmídeo inerte e o reagente lipídico de transfeção.Para experimentos eletrofisiológicos, inclua

controllable-ion-channel-expression-through-inducible-transient

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Vamos demonstrar como estudar o efeito de uma única mutação de ponto na função de um canal iônico.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

Fonte: Berens, C. et al. Aplicação de um sistema de expressão induzível para estudar a interferência dos fatores de virulência bacteriana com a sinalização intracelular. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o uso de um sistema de expressão induzível para identificar onde a proteína efetora bacteriana CaeB interrompe a cascata apoptótica do hospedeiro. Ele descreve as etapas para transfectar células que expressam CaeB com um sistema responsivo à tetraciclina, a fim de induzir a expressão...

Transfecção de um sistema de expressão gênica induzível em células que expressam uma proteína efetora bacteriana

Este vídeo descreve o método de regulação da expressão gênica em células cultivadas por transfecção com um plasmídeo contendo um gene de interesse e um plasmídeo regulador. A expressão deste plasmídeo pode ser controlada pela tetraciclina ou seus análogos sintéticos, tornando este sistema um modelo útil para estudar a expressão gênica regulável.

Sistema Regulado Tet-Off Induzível: Um Método In Vitro para Modular a Expressão Gênica em Células Cultivadas Usando o Sistema Tetraciclina-Off

O método descrito aqui é usado para induzir a cascata de sinalização apoptótica em etapas definidas, a fim de dissecar a atividade de uma proteína efetora bacteriana antiapoptótica. Este método também pode ser usado para expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicas, ou para dissecar interferência com outras vias de sinalização.

Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

arritmias cardíacas hereditárias são geralmente causadas por mutações que alteram a entrega de superfície de um ou mais canais de íons. Aqui, nós adaptar ensaios de citometria de fluxo para proporcionar uma quantificação da expressão de proteína total e a superfície celular relativa dos canais de iões recombinantes expressas em células TSA-201.

Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

sistemas de expressão em células de insecto Nonlytic são pouco utilizados para a produção, o tráfico celular / localização, e a análise funcional da proteína recombinante. Aqui, nós descrevemos métodos para gerar vectores de express e subsequente expressão da proteína transiente em linhas de células de lepidópteros disponíveis comercialmente. A co-localizao de aquaporinas de Bemisia tabaci com proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares também é apresentada.

Expressão transitória e Celular Localização de proteínas recombinantes em células de cultura de insectos

Aqui, apresentamos um protocolo para a modulação da expressão do transgene usando pEUI(+) singular gene interruptor por tebufenozide tratamento.

Um isoinokosterone baseado no Receptor Singular Gene interruptor para deliberada expressão do Transgene com robustez, reversibilidade e insignificante Leakiness

Aqui nós apresentamos um protocolo para desenvolver um sistema inducible negativo dominante, em que qualquer proteína pode ser condicionalmente inativada pela superexpressão reversivelmente uma versão mutante dominante negativo dele.

Inibição de proteína inducible e reversível dominante-negativo (DN)

Este estudo descreve um método para experimentos de alto rendimento usando uma matriz de LED impressa em 3D para otimizar a expressão gênica induzível por luz em células HEK293T.

Otimização rápida de um sistema induzível por luz para controlar a expressão gênica de mamíferos

Aprenda a controlar a expressão de canais iônicos em sistemas heterólogos usando transfecção transiente com promotor induzível. Este método simplifica estudos de farmacologia e melhora a replicabilidade experimental.

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

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