Name: Entrega bacteriana de RNAi Effectors: Transkingdom RNAi (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprenda a técnica de RNAi transkingdom para entrega de shRNA em células cancerígenas usando bactérias E. coli não patogênicas. Este método supera a resistência multidrogas em tratamentos oncológicos.

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Trabalho foi financiado por bolsa nenhuma. 01GU0615 do &quot;Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).

1) Entrega bacteriana da shRNAs <ol><li> Antes de iniciar com a cultura bacteriana, um tem que se preparar LB médio e LB-ágar. </li><li> Para o LB médio pesar extrato de levedura (0,5% w / v), Bacto triptona (1,0% w / v) e NaCl (0,6% w / v) e diluir estes componentes em água bidest. As soluções preparadas têm que ser esterilizados em autoclave e são, então, pronto para uso. </li><li> Para LB-agar agar Bacto placas (1,5% w / v) tem de ser adicionado à LB médio anteriores à esterilização. </li><li> Aquecer LB-ágar no microondas até que o LB-ágar esteja completamente dissolvido. Deixe a solução esfriar até que a garrafa pode ser tocado facilmente sem se queimar. Adicionar canamicina (100 mg / ml) para a seleção de clones positivos em outras etapas. </li><li> Prepare LB-ágar placas em um banco de fluxo laminar (condições estéreis) pipetando 20 ml da solução de LB-ágar em 10 cm de Petri-pratos. Deixe arrefecer as placas até que o líquido tornou-se sólido. As placas estão agora prontos para usar e pode ser armazenado a 4 ° C. </li><li> Vetores shRNA codificação expressão são transformados em E. competente ceq221 coli por choque térmico usando o procedimento de CaCl 2. </li><li> A placa de bactérias transformadas em LB-ágar placas contendo 100 mg / ml de canamicina, feche a tampa, selar as placas com parafilme e cultivar de cabeça para baixo a 37 ° C durante a noite. </li><li> Inocular culturas bacterianas com mini-clones positivos escolhendo colônias crescidas com uma picareta do dente. Transferir o palito em 7,0 ml de LB fresco médio, contendo 100 mg / ml kanamicina e cultivar a 37 ° C durante a noite em um shaker a 200 rpm. </li><li> Inocular 100 ml de LB fresco médio, contendo 100 mg / ml kanamicina 1:100 com a cultura ao longo da noite em um mini-1 frasco Erlenmeyer l, e incubar a 37 ° C durante a noite em um shaker a 200 rpm. </li><li> Semente de 25 x 10 4 (número de células inoculadas depende da velocidade do crescimento das células da linha celular de acordo; confluência deve ser 70-80% ~ 24 horas após a semeadura) células de carcinoma gástrico (EPG85-257RDB) por poço em 6 - pratos bem e incubar estes em 37 ° C, em um CO 2, 5% de água atmosfera saturada de vapor durante a noite. </li><li> Anterior à infecção de células cancerosas, ao longo culturas noite de tk RNAi vector contendo E. coli são medidos em um fotômetro para determinar a OD 600. Diluir a solução de bactérias até uma densidade óptica de 0,5 é atingido (OD 600 = 0,5 é igual a 1,6 x 10 8 células bacterianas / ml). </li><li> Substituir o FCS contendo meio de cultura de células do carcinoma de células contra FCS meio livre 30 min anterior para bacterianas co-incubação. </li><li> Lavar as bactérias duas vezes com 1 x PBS, e diluir em soro livre de Leibovitz L-15 médio. </li><li> Adicionar bactérias diluído para as células cancerosas na desejado MOI (multiplicidade de infecção = número de células bacterianas por célula de câncer) e co-incubação de bactérias e células de câncer por 2 horas a 37 ° C. </li><li> Após 2 horas de células co-incubação de câncer foram lavadas duas vezes com PBS 1x x e uma vez com o soro contendo Leibovitz L-15 meio suplementado com 100 u / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / ml, 2,5 mg / ml anfotericina, 150 mg / ml de gentamicina, e 100 mg / ml de canamicina. </li><li> Continuar a cultivar as células cancerosas a 37 ° C, em um CO 2, 5% de água atmosfera de vapor saturado. </li><li> Os efeitos do tratamento de bactérias pode ser visualizada por microscopia fluorescente, medido pelo quantitativo em tempo real RT PCR em nível de mRNA, e pela análise de western blot em nível de proteína, e mostra com ensaios funcionais como FACS, análise e ensaios de proliferação celular. (Se queria, estes procedimentos podem ser descritos em detalhe). </li></ol> 2) Resultados Representante Se o protocolo for realizado corretamente, os resultados devem ser comparáveis ​​aos mostrado abaixo. Microscopia de fluorescência A Figura 1 mostra uma célula de carcinoma gástrico humano três horas após o tratamento bacteriana (a) em comparação com uma célula não tratada (b). Ao redor do núcleo da célula tratada, as bactérias podem ser detectadas. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: microscopia fluorescente de células de carcinoma gástrico Humanos após o tratamento de bactérias (1:500) e uma célula de carcinoma gástrico humano sem tratamento como controle, DAPI-coloração, DAPI bandpass filter (Λem = 640 nm), objetiva de 40x. Quantitativa em tempo real RT PCR Na figura 2 um regulamento para baixo de MDR1 mRNA de cerca de 70% (feixe de preto) pode ser visto após o tratamento com a bactéria terapêutico. Células dos pais servem como um controle positivo, devido à falta de MDR1 superexpressão. A linhagem celular 257RDB p170 contendo um plasmídeo expressando anti-MDR1 shRNAs s tomado como comparação direta da tecnologia de RNAi para R transkingdom outrosNAi silenciar estratégias. A linhagem de células resistentes tratadas EPG85-257RDB superexpressão MDR1, a linha de celular mesmo tratados com bactérias sem o plasmídeo shRNA expressar, e esta linhagem de células tratadas com bactérias terapêutica carregando um plasmídeo expressando anti-MRP2 shRNAs foram tomados como controles positivos. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: quantitativa em tempo real RT PCR a expressão do mRNA MDR1 após o tratamento com E. terapêutica ceq221 coli expressando anti-MDR1 shRNAs (MOI 1: 500). Normalização foi realizada através do aldolase gene housekeeping. A relação MDR1/aldolase de células não tratadas da linha celular EPG85-257RDB foram criados 100%. P-valores foram calculados usando o teste t de Student (* = p &lt;0,05, ** = p &lt;0,005, *** = p &lt;0,001). Ocidental blot Figura 3 revela que a MDR1 regulação também ocorreu no nível de proteína após o tratamento de bactérias. Ela mostra a falta de expressão da MDR1 linhagem de células de drogas sensíveis parental (EPG85-257p), a expressão da MDR1 não tratada linhagem de células resistentes aos medicamentos (EPG85-257RDB) ea expressão MDR1 da amostra tratada. A regulamentação clara para baixo de MDR1 das células tratadas com bactérias pode ser observada. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: análise de Western blot MDR1 níveis de expressão do tratado de drogas sensíveis EPG85-257p, a não tratada resistentes a drogas EPG-257RDB, e de EPG85-257RDB após co-incubação com E.. coli ceq221 + p43 MDR1. Principal Ab C219 1:100, e anti-actina 1:5 000, secundário Ab anti-mouse 1:10 000. Ensaio de citotoxicidade Análise funcional como o ensaio de citotoxicidade mostrado na figura 4 também são indicadores para o funcionamento do RNAi transkingdom. A linhagem de células parentais e da linha de célula que contém um shRNA anit-MDR1 expressar plasmídeo não mostram qualquer resistência à daunorrubicina. A linhagem de células resistentes EPG85-257RDB e dois controles ainda não mostram mudanças significativas na resistência em comparação com a amostra tratada com anti-bactérias MDR1 shRNA expressando onde a resistência à daunorrubicina pode ser revertido em cerca de 90%. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: Ensaio de Citotoxicidade. Drogas específicas IC50-valores determinados por um ensaio de citotoxicidade para a sobrevivência da célula. P-valores foram calculados usando o teste t de Student (* = p &lt;0,05, ** = p &lt;0,005, *** = p &lt;0,001). Antraciclina ensaio de acumulação De acordo com a baixa resistência de amostras de bactérias tratada (figura 4), o acúmulo de células antraciclina anti-MDR1 shRNA tratada é aumentada em cerca de 90%, como mostrado na figura 5. A linhagem de células parentais e as linha celular 257RDB p170 mostram uma forte acumulação daunorrubicina até 100%. A variante resistente mostra raramente qualquer acumulação. Células tratadas com anti-bactérias MDR1 shRNA expressar mostram um aumento de acumulação anthracyline de 90%. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: ensaio de antraciclina acumulação. Antraciclina acúmulo de células de carcinoma seis dias após o tratamento de bactérias medida por citometria de fluxo. P-valores foram calculados usando o teste t de Student (* = p &lt;0,05, ** = p &lt;0,005, *** = p &lt;0,001).

<ol><li>Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs+by+transkingdom+RNA+interference+modulates+the+classical+ABCB1-mediated+multidrug-resistant+phenotype+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells.</a> Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDR1%2FP-glycoprotein+%28ABCB1%29+as+target+for+RNA+interference-mediated+reversal+of+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+cancer+multidrug+resistance%3A+a+still+unsolved+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+RNA+interference+in+drug-resistant+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Fut.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers.</a> Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).</li>
<li>Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transkingdom+RNA+interference+%28tkRNAi%29%3A+a+novel+method+to+induce+therapeutic+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing.</a> Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).</li>
<li>Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+classical+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+RNA+interference+%28RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi.</a> FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).</li>
<li>Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+and+complete+overcoming+of+MDR1%2FP-glycoprotein-mediated+multidrug+resistance+in+human+gastric+carcinoma+cells+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference.</a> Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).</li>
<li>Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+in+vivo+reversal+of+the+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+jet-injection+of+anti-MDR1+short+hairpin+RNA-encoding+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA.</a> Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).</li>
<li>Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA-expressing+bacteria+elicit+RNA+interference+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals.</a> Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O número de células semeadas para a infecção e os MOI correspondentes utilizados, dependem criticamente as linhas de células sob observação e sua velocidade de crescimento. Para encontrar o número de células ideal para a semeadura, a pré-experimentos para determinar a velocidade de crescimento são fortemente recomendados. Além disso, MOIS diferentes devem ser testados, devido à limitada estender-se que as células podem suportar a invasão bacteriana sem morrer de stress. O ponto ótimo de tempo em que a regulação para bai...

<table><tbody><tr><td>Ágar</td><td>Biochrom AG</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Biochrom AG</td><td>A2612</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco – PBS (10 x)</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>14080048</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ceq221</td><td>Cequent Pharmaceuticals Inc.</td><td></td><td>Sem catálogo disponível, pedido direto</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Biochrom AG</td><td>A2710</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen GmbH</td><td></td><td>Contém 5.000 unidades de penicilina (base) e 5.000 &amp;mu;g de estreptomicina (base)/ml, utilizando penicilina G (sal de sódio) e sulfato de estreptomicina em solução salina a 0,85%.</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Merck KgaA</td><td>1064060500</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Difco Laboratories</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Difco Laboratories</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

entrega bacteriana de rnai effectors: transkingdom rnai

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

Interferência de RNA (RNAi) representa um mecanismo de alto eficaz para inibição específica de expressão de mRNA. Além de seu potencial como uma ferramenta poderosa de laboratório, a via RNAi parece ser promissor para uso terapêutico. Para o desenvolvimento de interferência de RNA (RNAi) baseado em terapias, a entrega de RNAi-agentes mediadores de células-alvo é um dos grandes obstáculos. A nova estratégia para superar este obstáculo é transkingdom RNAi (tk RNAi). Esta tecnologia utiliza bactérias não-patogênicas, por exemplo, Escherichia coli, para produzir e entregar terapêutica curto hairpin RNA (shRNA) em células-alvo para induzir RNAi. A primeira geração tk RNAi-mediadora vector TRIP, contém o bacteriófago T7 promoter de regulação da expressão de um shRNA terapêutico de interesse. Além disso, TRIP tem o locus de Inv Yersinia pseudotuberculosis, que codifica invasin, que permite que as bactérias naturais não-invasivo para entrar β1 positiva de integrina células de mamíferos eo gene HlyA de Listeria monocytogenes, que produz listeriolisina O. Esta enzima permite que o shRNA terapêuticas para escapar entrada vesículas no citoplasma da célula-alvo. Constrói TRIP são introduzidos em um competente coli cepa não-patogênica coli, que codifica T7 RNA polimerase necessário para a síntese T7 promoter-driven de shRNAs. A molécula-alvo bem caracterizado de câncer associados para diferentes estratégias RNAi é ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Esta ABC-transportador atua como uma bomba de extrusão de drogas e media o &quot;clássico&quot; resistência a múltiplas drogas ABCB1 mediada (MDR) fenótipo de células de câncer humano, que é caracterizado por um padrão específico de resistência cruzada. ABCB1 expressando diferentes células de câncer de MDR foram tratados com anti-ABCB1 expressão shRNA vector rolamento E. coli. Este procedimento resultou na ativação das vias RNAi nas células do câncer e de um regulamento considerável para baixo do mRNA codificação ABCB1, bem como a bomba de extrusão correspondente drogas. Assim, a acumulação de drogas foi reforçada no pristine células resistentes a drogas câncer eo fenótipo MDR foi revertida. Por meio deste modelo os dados fornecem a prova de conceito que tk RNAi é adequado para a modulação de câncer de fatores associados, como por exemplo ABCB1, em células de câncer humano.

Para o desenvolvimento de interferência de RNA (RNAi) baseado em terapias, uma nova estratégia foi desenvolvida, transkingdom RNAi (tkRNAi). Esta tecnologia utiliza bactérias não-patogênicas de produzir e entregar terapêutica curto hairpin RNA (shRNA) em células-alvo. Aqui, tkRNAi foi aplicado com sucesso para a reversão de multirresistência clássica ABCB1 mediada (MDR) de células cancerosas.

Entrega bacteriana de RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

A interferência de RNA (RNAi) representa um mecanismo altamente eficaz para a inibição específica da expressão de mRNA. Além do seu potencial como uma poderosa ferramenta de laboratório...

No método transgênico, a interferência por RNA ou procedimento RNAi, bactérias são utilizadas para entregar RNAs em formato de alça curta ou RNAs direcionados contra o gene de interesse MDR1 neste protocolo em células cancerígenas, com o objetivo de silenciar o gene de interesse por RNAi. Primeiramente, bactérias Escherichia coli são transformadas com um vetor que expressa um shRNA. Em seguida, células cancerígenas beta1-positivas são semeadas de modo que a confluência seja de 70% a 80% após 24 horas da semeadura. Na próxima etapa, as bactérias que expressam shRNA e as células são coincubadas por duas horas.Por fim, a co-incubação é interrompida pelo tratamento com antibiótico das células cancerígenas. Os resultados mostram uma regulação negativa do gene de interesse nos níveis de mRNA, proteína e funcional por meio de PCR em tempo real, análise por Western blot, ensaios de proliferação celular e ensaios de acúmulo de fármacos. A principal vantagem desta técnica em relação a outros procedimentos padrão, como a transfeção com S-I-R-N-A, utilizando oligoefeito médio, é a entrega eficaz e direta de irna nas células-alvo.A RNAi Trans-Reino, ou tecnologia TK RNAi, utiliza E. coli não pa

bacterial-delivery-of-rnai-effectors-transkingdom-rnai

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Interferência de RNA (RNAi) técnicas de genes baseados em knockdown estão no centro de pesquisa Tribolium. Aqui, nós fornecemos uma visão geral de nossa técnica de RNAi larval em Tribolium castaneum. Larval RNAi é uma técnica simples, mas poderosa que fornece acesso rápido a fenótipos de perda de função, permitindo que os pesquisadores para estudar as funções dos genes em diversos contextos.

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Descrevemos um método para derrubar a expressão gênica em uma população crescente de células de E. coli usando de expressão de sRNA direcionados à sequência entregues por um vetor fagemídeo M13.

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A interferência de RNA (RNAi) é uma ferramenta extremamente valiosa para descobrir a função do gene. No entanto, a capacidade de direcionar genes usando RNAi durante os estágios pré-adultos é limitada no principal vetor da malária humana, Anopheles gambiae. Descrevemos um protocolo de RNAi para reduzir a função do gene por meio de injeção direta durante o desenvolvimento da pupa.

RNAi gatilho para o interior<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; As pupas

Aqui, apresentamos os protocolos de criação de um besouro intermediário de germes, Dermestes maculatus (D. maculatus) no laboratório. Também compartilhamos protocolos de RNAi embrionário e parental e métodos para análise de fenótipos embrionárias para estudar a função de genes nesta espécie.

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle, Dermestes maculatus

Este artigo demonstra novas técnicas desenvolvidas para entrega oral de RNA double-stranded (dsRNA) através dos tecidos vasculares das plantas para o RNA de interferência (RNAi) na seiva do floema alimentação de insetos.

Métodos de entrega Double-stranded RNA Oral para induzir a interferência do RNA no floema e insetos Hemipteran planta-sap-alimentação

A interferência de RNA é uma técnica amplamente aplicável e poderosa para manipular a expressão genética em estágios específicos de desenvolvimento. Aqui, descrevemos os passos necessários para a implementação dessa técnica no besouro de mergulho aquático Thermonectus marmoratus, desde a aquisição de sequências genéticas até o knockdown de genes que afetam a estrutura ou o comportamento.

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Um sistema de recombinação mediado por λ-Red foi usado para criar um mutante de deleção de um pequeno micC de RNA não-codificante.

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A administração oral do dsRNA produzido por bactérias, um método de entrega para interferência de RNA (RNAi) que é rotineiramente utilizado em caenorhabditis elegans, foi aplicada com sucesso aqui em mosquitos adultos. Nosso método permite estudos robustos de genética reversa e estudos de vetores de bloqueio de transmissão sem o uso de injeção.

Administração eficaz de interferência oral de RNA (RNAi) para mosquitos anofeeles gâmbias adultos

Reversa abordagens genéticas têm-se revelado extremamente útil para determinar quais genes de resistência a patógenos underly vetor em mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra um método utilizado pelo laboratório Dimopoulos para injetar dsRNA em mosquitos Anopheles gambiae, que abrigam o parasita da malária. A técnica de manipular a configuração da injeção e injetar dsRNA no tórax é ilustrado.

Protocolo para Ensaios RNAi em mosquitos adultos (A. gambiae)

Neste vídeo, mostramos um procedimento para uma entrega precisa biobalística de reagentes em tecido vivo com uma arma gene romance em miniatura. Estamos derrubando a expressão da molécula de orientação netrin axônio em embriões de sanguessuga, fornecendo moléculas de dsRNA na parede ventral do corpo e gânglios dos segmentos individuais.

Localizada RNAi e Expressão Gênica ectópica na sanguessuga medicinal

Aprenda a técnica de RNAi transkingdom para entrega de shRNA em células cancerígenas usando bactérias E. coli não patogênicas. Este método supera a resistência multidrogas em tratamentos oncológicos.

Entrega bacteriana de RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

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