Name: Entrega bacteriana de RNAi Effectors: Transkingdom RNAi (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprenda a técnica de RNAi transkingdom para entrega de shRNA em células cancerígenas usando bactérias E. coli não patogênicas. Este método supera a resistência multidrogas em tratamentos oncológicos.

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Trabalho foi financiado por bolsa nenhuma. 01GU0615 do &quot;Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).

1) Entrega bacteriana da shRNAs <ol><li> Antes de iniciar com a cultura bacteriana, um tem que se preparar LB médio e LB-ágar. </li><li> Para o LB médio pesar extrato de levedura (0,5% w / v), Bacto triptona (1,0% w / v) e NaCl (0,6% w / v) e diluir estes componentes em água bidest. As soluções preparadas têm que ser esterilizados em autoclave e são, então, pronto para uso. </li><li> Para LB-agar agar Bacto placas (1,5% w / v) tem de ser adicionado à LB médio anteriores à esterilização. </li><li> Aquecer LB-ágar no microondas até que o LB-ágar esteja completamente dissolvido. Deixe a solução esfriar até que a garrafa pode ser tocado facilmente sem se queimar. Adicionar canamicina (100 mg / ml) para a seleção de clones positivos em outras etapas. </li><li> Prepare LB-ágar placas em um banco de fluxo laminar (condições estéreis) pipetando 20 ml da solução de LB-ágar em 10 cm de Petri-pratos. Deixe arrefecer as placas até que o líquido tornou-se sólido. As placas estão agora prontos para usar e pode ser armazenado a 4 ° C. </li><li> Vetores shRNA codificação expressão são transformados em E. competente ceq221 coli por choque térmico usando o procedimento de CaCl 2. </li><li> A placa de bactérias transformadas em LB-ágar placas contendo 100 mg / ml de canamicina, feche a tampa, selar as placas com parafilme e cultivar de cabeça para baixo a 37 ° C durante a noite. </li><li> Inocular culturas bacterianas com mini-clones positivos escolhendo colônias crescidas com uma picareta do dente. Transferir o palito em 7,0 ml de LB fresco médio, contendo 100 mg / ml kanamicina e cultivar a 37 ° C durante a noite em um shaker a 200 rpm. </li><li> Inocular 100 ml de LB fresco médio, contendo 100 mg / ml kanamicina 1:100 com a cultura ao longo da noite em um mini-1 frasco Erlenmeyer l, e incubar a 37 ° C durante a noite em um shaker a 200 rpm. </li><li> Semente de 25 x 10 4 (número de células inoculadas depende da velocidade do crescimento das células da linha celular de acordo; confluência deve ser 70-80% ~ 24 horas após a semeadura) células de carcinoma gástrico (EPG85-257RDB) por poço em 6 - pratos bem e incubar estes em 37 ° C, em um CO 2, 5% de água atmosfera saturada de vapor durante a noite. </li><li> Anterior à infecção de células cancerosas, ao longo culturas noite de tk RNAi vector contendo E. coli são medidos em um fotômetro para determinar a OD 600. Diluir a solução de bactérias até uma densidade óptica de 0,5 é atingido (OD 600 = 0,5 é igual a 1,6 x 10 8 células bacterianas / ml). </li><li> Substituir o FCS contendo meio de cultura de células do carcinoma de células contra FCS meio livre 30 min anterior para bacterianas co-incubação. </li><li> Lavar as bactérias duas vezes com 1 x PBS, e diluir em soro livre de Leibovitz L-15 médio. </li><li> Adicionar bactérias diluído para as células cancerosas na desejado MOI (multiplicidade de infecção = número de células bacterianas por célula de câncer) e co-incubação de bactérias e células de câncer por 2 horas a 37 ° C. </li><li> Após 2 horas de células co-incubação de câncer foram lavadas duas vezes com PBS 1x x e uma vez com o soro contendo Leibovitz L-15 meio suplementado com 100 u / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / ml, 2,5 mg / ml anfotericina, 150 mg / ml de gentamicina, e 100 mg / ml de canamicina. </li><li> Continuar a cultivar as células cancerosas a 37 ° C, em um CO 2, 5% de água atmosfera de vapor saturado. </li><li> Os efeitos do tratamento de bactérias pode ser visualizada por microscopia fluorescente, medido pelo quantitativo em tempo real RT PCR em nível de mRNA, e pela análise de western blot em nível de proteína, e mostra com ensaios funcionais como FACS, análise e ensaios de proliferação celular. (Se queria, estes procedimentos podem ser descritos em detalhe). </li></ol> 2) Resultados Representante Se o protocolo for realizado corretamente, os resultados devem ser comparáveis ​​aos mostrado abaixo. Microscopia de fluorescência A Figura 1 mostra uma célula de carcinoma gástrico humano três horas após o tratamento bacteriana (a) em comparação com uma célula não tratada (b). Ao redor do núcleo da célula tratada, as bactérias podem ser detectadas. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: microscopia fluorescente de células de carcinoma gástrico Humanos após o tratamento de bactérias (1:500) e uma célula de carcinoma gástrico humano sem tratamento como controle, DAPI-coloração, DAPI bandpass filter (Λem = 640 nm), objetiva de 40x. Quantitativa em tempo real RT PCR Na figura 2 um regulamento para baixo de MDR1 mRNA de cerca de 70% (feixe de preto) pode ser visto após o tratamento com a bactéria terapêutico. Células dos pais servem como um controle positivo, devido à falta de MDR1 superexpressão. A linhagem celular 257RDB p170 contendo um plasmídeo expressando anti-MDR1 shRNAs s tomado como comparação direta da tecnologia de RNAi para R transkingdom outrosNAi silenciar estratégias. A linhagem de células resistentes tratadas EPG85-257RDB superexpressão MDR1, a linha de celular mesmo tratados com bactérias sem o plasmídeo shRNA expressar, e esta linhagem de células tratadas com bactérias terapêutica carregando um plasmídeo expressando anti-MRP2 shRNAs foram tomados como controles positivos. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: quantitativa em tempo real RT PCR a expressão do mRNA MDR1 após o tratamento com E. terapêutica ceq221 coli expressando anti-MDR1 shRNAs (MOI 1: 500). Normalização foi realizada através do aldolase gene housekeeping. A relação MDR1/aldolase de células não tratadas da linha celular EPG85-257RDB foram criados 100%. P-valores foram calculados usando o teste t de Student (* = p &lt;0,05, ** = p &lt;0,005, *** = p &lt;0,001). Ocidental blot Figura 3 revela que a MDR1 regulação também ocorreu no nível de proteína após o tratamento de bactérias. Ela mostra a falta de expressão da MDR1 linhagem de células de drogas sensíveis parental (EPG85-257p), a expressão da MDR1 não tratada linhagem de células resistentes aos medicamentos (EPG85-257RDB) ea expressão MDR1 da amostra tratada. A regulamentação clara para baixo de MDR1 das células tratadas com bactérias pode ser observada. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: análise de Western blot MDR1 níveis de expressão do tratado de drogas sensíveis EPG85-257p, a não tratada resistentes a drogas EPG-257RDB, e de EPG85-257RDB após co-incubação com E.. coli ceq221 + p43 MDR1. Principal Ab C219 1:100, e anti-actina 1:5 000, secundário Ab anti-mouse 1:10 000. Ensaio de citotoxicidade Análise funcional como o ensaio de citotoxicidade mostrado na figura 4 também são indicadores para o funcionamento do RNAi transkingdom. A linhagem de células parentais e da linha de célula que contém um shRNA anit-MDR1 expressar plasmídeo não mostram qualquer resistência à daunorrubicina. A linhagem de células resistentes EPG85-257RDB e dois controles ainda não mostram mudanças significativas na resistência em comparação com a amostra tratada com anti-bactérias MDR1 shRNA expressando onde a resistência à daunorrubicina pode ser revertido em cerca de 90%. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: Ensaio de Citotoxicidade. Drogas específicas IC50-valores determinados por um ensaio de citotoxicidade para a sobrevivência da célula. P-valores foram calculados usando o teste t de Student (* = p &lt;0,05, ** = p &lt;0,005, *** = p &lt;0,001). Antraciclina ensaio de acumulação De acordo com a baixa resistência de amostras de bactérias tratada (figura 4), o acúmulo de células antraciclina anti-MDR1 shRNA tratada é aumentada em cerca de 90%, como mostrado na figura 5. A linhagem de células parentais e as linha celular 257RDB p170 mostram uma forte acumulação daunorrubicina até 100%. A variante resistente mostra raramente qualquer acumulação. Células tratadas com anti-bactérias MDR1 shRNA expressar mostram um aumento de acumulação anthracyline de 90%. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: ensaio de antraciclina acumulação. Antraciclina acúmulo de células de carcinoma seis dias após o tratamento de bactérias medida por citometria de fluxo. P-valores foram calculados usando o teste t de Student (* = p &lt;0,05, ** = p &lt;0,005, *** = p &lt;0,001).

<ol><li>Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs+by+transkingdom+RNA+interference+modulates+the+classical+ABCB1-mediated+multidrug-resistant+phenotype+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells.</a> Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDR1%2FP-glycoprotein+%28ABCB1%29+as+target+for+RNA+interference-mediated+reversal+of+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+cancer+multidrug+resistance%3A+a+still+unsolved+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+RNA+interference+in+drug-resistant+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Fut.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers.</a> Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).</li>
<li>Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transkingdom+RNA+interference+%28tkRNAi%29%3A+a+novel+method+to+induce+therapeutic+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing.</a> Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).</li>
<li>Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+classical+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+RNA+interference+%28RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi.</a> FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).</li>
<li>Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+and+complete+overcoming+of+MDR1%2FP-glycoprotein-mediated+multidrug+resistance+in+human+gastric+carcinoma+cells+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference.</a> Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).</li>
<li>Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+in+vivo+reversal+of+the+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+jet-injection+of+anti-MDR1+short+hairpin+RNA-encoding+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA.</a> Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).</li>
<li>Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA-expressing+bacteria+elicit+RNA+interference+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals.</a> Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O número de células semeadas para a infecção e os MOI correspondentes utilizados, dependem criticamente as linhas de células sob observação e sua velocidade de crescimento. Para encontrar o número de células ideal para a semeadura, a pré-experimentos para determinar a velocidade de crescimento são fortemente recomendados. Além disso, MOIS diferentes devem ser testados, devido à limitada estender-se que as células podem suportar a invasão bacteriana sem morrer de stress. O ponto ótimo de tempo em que a regulação para bai...

<table><tbody><tr><td>Ágar</td><td>Biochrom AG</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Biochrom AG</td><td>A2612</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco – PBS (10 x)</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>14080048</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ceq221</td><td>Cequent Pharmaceuticals Inc.</td><td></td><td>Sem catálogo disponível, pedido direto</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Biochrom AG</td><td>A2710</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen GmbH</td><td></td><td>Contém 5.000 unidades de penicilina (base) e 5.000 &amp;mu;g de estreptomicina (base)/ml, utilizando penicilina G (sal de sódio) e sulfato de estreptomicina em solução salina a 0,85%.</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Merck KgaA</td><td>1064060500</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Difco Laboratories</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Difco Laboratories</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

entrega bacteriana de rnai effectors: transkingdom rnai

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

Interferência de RNA (RNAi) representa um mecanismo de alto eficaz para inibição específica de expressão de mRNA. Além de seu potencial como uma ferramenta poderosa de laboratório, a via RNAi parece ser promissor para uso terapêutico. Para o desenvolvimento de interferência de RNA (RNAi) baseado em terapias, a entrega de RNAi-agentes mediadores de células-alvo é um dos grandes obstáculos. A nova estratégia para superar este obstáculo é transkingdom RNAi (tk RNAi). Esta tecnologia utiliza bactérias não-patogênicas, por exemplo, Escherichia coli, para produzir e entregar terapêutica curto hairpin RNA (shRNA) em células-alvo para induzir RNAi. A primeira geração tk RNAi-mediadora vector TRIP, contém o bacteriófago T7 promoter de regulação da expressão de um shRNA terapêutico de interesse. Além disso, TRIP tem o locus de Inv Yersinia pseudotuberculosis, que codifica invasin, que permite que as bactérias naturais não-invasivo para entrar β1 positiva de integrina células de mamíferos eo gene HlyA de Listeria monocytogenes, que produz listeriolisina O. Esta enzima permite que o shRNA terapêuticas para escapar entrada vesículas no citoplasma da célula-alvo. Constrói TRIP são introduzidos em um competente coli cepa não-patogênica coli, que codifica T7 RNA polimerase necessário para a síntese T7 promoter-driven de shRNAs. A molécula-alvo bem caracterizado de câncer associados para diferentes estratégias RNAi é ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Esta ABC-transportador atua como uma bomba de extrusão de drogas e media o &quot;clássico&quot; resistência a múltiplas drogas ABCB1 mediada (MDR) fenótipo de células de câncer humano, que é caracterizado por um padrão específico de resistência cruzada. ABCB1 expressando diferentes células de câncer de MDR foram tratados com anti-ABCB1 expressão shRNA vector rolamento E. coli. Este procedimento resultou na ativação das vias RNAi nas células do câncer e de um regulamento considerável para baixo do mRNA codificação ABCB1, bem como a bomba de extrusão correspondente drogas. Assim, a acumulação de drogas foi reforçada no pristine células resistentes a drogas câncer eo fenótipo MDR foi revertida. Por meio deste modelo os dados fornecem a prova de conceito que tk RNAi é adequado para a modulação de câncer de fatores associados, como por exemplo ABCB1, em células de câncer humano.

Para o desenvolvimento de interferência de RNA (RNAi) baseado em terapias, uma nova estratégia foi desenvolvida, transkingdom RNAi (tkRNAi). Esta tecnologia utiliza bactérias não-patogênicas de produzir e entregar terapêutica curto hairpin RNA (shRNA) em células-alvo. Aqui, tkRNAi foi aplicado com sucesso para a reversão de multirresistência clássica ABCB1 mediada (MDR) de células cancerosas.

Entrega bacteriana de RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

A interferência de RNA (RNAi) representa um mecanismo altamente eficaz para a inibição específica da expressão de mRNA. Além do seu potencial como uma poderosa ferramenta de laboratório...

No método transgênico, a interferência por RNA ou procedimento RNAi, bactérias são utilizadas para entregar RNAs em formato de alça curta ou RNAs direcionados contra o gene de interesse MDR1 neste protocolo em células cancerígenas, com o objetivo de silenciar o gene de interesse por RNAi. Primeiramente, bactérias Escherichia coli são transformadas com um vetor que expressa um shRNA. Em seguida, células cancerígenas beta1-positivas são semeadas de modo que a confluência seja de 70% a 80% após 24 horas da semeadura. Na próxima etapa, as bactérias que expressam shRNA e as células são coincubadas por duas horas.Por fim, a co-incubação é interrompida pelo tratamento com antibiótico das células cancerígenas. Os resultados mostram uma regulação negativa do gene de interesse nos níveis de mRNA, proteína e funcional por meio de PCR em tempo real, análise por Western blot, ensaios de proliferação celular e ensaios de acúmulo de fármacos. A principal vantagem desta técnica em relação a outros procedimentos padrão, como a transfeção com S-I-R-N-A, utilizando oligoefeito médio, é a entrega eficaz e direta de irna nas células-alvo.A RNAi Trans-Reino, ou tecnologia TK RNAi, utiliza E. coli não patogênicas para produzir e entregar RNA de haste curta terapêutico, ou hrna, em células-alvo para induzir a RNAi. Um vetor mediador de TK RNAi de primeira geração, ou trip, contém o promotor do fago T7 de bactérias para a regulação da expressão de um shRNA terapêutico de interesse. Além disso, o trip contém o locus inv de Yersinia pseudotuberculosis, que codifica a invasina, permitindo que bactérias naturalmente não invasivas entrem em células de mamíferos positivas para integrina beta 1.Tripp também inclui o gene hli, A, de Listeria monocytogenes, que produz a listeriolisina O. Esta enzima permite que o HRNA terapêutico escape das vesículas de entrada no citoplasma da célula-alvo. Os construtos Trop são introduzidos numa linhagem competente de Escherichia coli não patogênica, que codifica a RNA polimerase T7 necessária para a síntese de SH RNAs sob controle do promotor T7. As bactérias e as células eucarióticas são co-incubadas, permitindo que as bactérias entrem nas células eucarióticas.Os RNAs SH são liberados e entram em uma via de RNAi. Para iniciar este procedimento, cultive uma cultura de bactérias Escherichia coli transformadas com o fator triplo expressando RNA-S-H-R, utilizando uma cultura de incubação prolongada conforme descrito no protocolo escrito anexo, no dia anterior. Incube as bactérias com as células-alvo, semeando 25 vezes 10 à quarta potência de células de carcinoma gástrico humano por poço em placas de seis poços.O número de células semeadas depende da velocidade de crescimento da linhagem celular; planeje o momento da semeadura de modo que a confluência esteja entre 70 e 80% após 24 horas. Após a semeadura, incubar as células semeadas a 37 graus Celsius em uma atmosfera saturada com vapor d'água e 5% de dióxido de carbono durante a noite. Antes de iniciar a infecção das células cancerígenas, medir a densidade óptica dos cultivos noturnos do vetor de RNAi de TK contendo *E. coli*.Determine a DO 600, dilua a solução bacteriana até uma densidade óptica de 0,5 30 minutos antes da coinubação bacteriana substituir o meio de cultura celular contendo FCS. Substitua o meio das células de carcinoma pelo meio livre de FCS durante o período de 30 minutos. Lave as bactérias duas vezes com PBS 1× por centrifugação a 4.000 RPM durante cinco minutos a quatro graus Celsius e reconstitua em meio livre de soro.L 15, meio até o volume diluído original. Uma vez que as bactérias sejam ressuspendidas e as células concluam seu período de incubação de 30 minutos, adicione as bactérias às células cancerígenas na multiplicidade de infecção ou RMI desejada, que deve estar na faixa de 1:300 a 1:700. Incube conjuntamente as bactérias e as células cancerígenas por duas horas a 37 graus Celsius em uma atmosfera saturada com vapor d'água e 5% de dióxido de carbono.Após duas horas de co-incubação, lave as células cancerígenas duas vezes com PBS uma vez e uma vez com meio L 15 contendo soro, suplementado com 100 unidades por mililitro de penicilina, 100 microgramas por litro de estreptomicina e 2,5 microgramas por mililitro.Anfotericina 150 microgramas por mililitro, gentamicina e 100 microgramas por mililitro. Pode-se continuar cultivando as células cancerígenas a 37 graus Celsius em uma atmosfera saturada de vapor d'água com 5% de dióxido de carbono? Os efeitos do tratamento bacteriano podem ser visualizados por microscopia fluorescente, medidos por RT-PCR quantitativa em tempo real no nível de mRNA e examinados por análise de western blot.Ensaios funcionais, como análise de fax e ensaios de proliferação celular, também podem ser utilizados. Esta imagem representativa foi obtida três horas após a incubação de células de carcinoma gástrico humano com bactérias expressando o agente terapêutico. Bactérias S-H-R-N-A podem ser detectadas ao redor do núcleo da célula tratada.Neste experimento, a subregulação da expressão do gene de resistência múltipla a fármacos MDR1 foi analisada por PCR em tempo real, mostrando uma subregulação do mRNA de mdr1 de cerca de 70% após o tratamento com uma bactéria terapêutica. A subregulação de MDR1 também ocorreu ao nível proteico após o tratamento bacteriano.Os níveis da proteína MDR1 diminuíram ao longo do tempo em comparação com a linhagem celular controle. A análise funcional com base nos resultados do ensaio de citotoxicidade apresentado aqui pode ser utilizada como um indicador do funcionamento do RNAi trans-reino, enquanto uma linhagem celular resistente a fármacos não responde ao medicamento anticâncer. Na linhagem celular infectada com bactérias transformadas com um plasmídeo que expressa shRNA anti-MDR1, observa-se sensibilidade ao fármaco.Por fim, em um ensaio de acúmulo de antraciclina, a linhagem celular resistente ao câncer mostrou pouco acúmulo do medicamento antineoplásico, o que foi observado nas células resistentes ao câncer tratadas com o MDR one SHRA Uma vez dominado. Esta técnica pode ser aplicada em até 28 horas se for realizada corretamente seguindo este procedimento. Outras técnicas, como a R-T-P-C-R, podem ser aplicadas para responder diversas questões, como os efeitos regulatórios sobre o gene de interesse.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como aplicar interferência de RNA trans-reino por meio da co-incubação de bactérias que expressam HRNA com células de mamíferos positivas para HRNA.

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Research

JoVE Journal

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Biologia

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A interferência RNA larval no Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Descrevemos um método para derrubar a expressão gênica em uma população crescente de células de E. coli usando de expressão de sRNA direcionados à sequência entregues por um vetor fagemídeo M13.

Entrega mediada por fago de sRNA alvejado Constrói para bater para baixo Expressão Gênica em<em&gt; E. coli</em

A interferência de RNA (RNAi) é uma ferramenta extremamente valiosa para descobrir a função do gene. No entanto, a capacidade de direcionar genes usando RNAi durante os estágios pré-adultos é limitada no principal vetor da malária humana, Anopheles gambiae. Descrevemos um protocolo de RNAi para reduzir a função do gene por meio de injeção direta durante o desenvolvimento da pupa.

RNAi gatilho para o interior<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; As pupas

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Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle, Dermestes maculatus

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Um sistema de recombinação mediado por λ-Red foi usado para criar um mutante de deleção de um pequeno micC de RNA não-codificante.

Um pequeno RNA não codificante MicC contribui para a virulência em proteínas da membrana externa em Salmonella enteritidis

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