No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

O objetivo geral do experimento a seguir é examinar os efeitos no desenvolvimento do knockdown ou superexpressão de genes em subconjuntos específicos de células progenitoras neuronais no neocórtex. Isso é obtido por eletroporação in vivo de DNA em embriões de ratos para transfectar células progenitoras neocorticais. Como segunda etapa, a região eletroporada é dissecada para enriquecer as células transfectadas.

Em seguida, essas células são dissociadas e plaqueadas em lâminas de câmara e cultivadas. A fim de examinar os efeitos da alteração genética intrínseca e da aplicação de fatores exógenos, foram obtidos resultados que mostram efeitos no crescimento e ramificação de neuritos com base em medições quantitativas usando o software avision. A principal vantagem dessa técnica sobre outras, como a transfecção à base de lipídios de culturas neuronais primárias, é que podemos atingir subconjuntos específicos de células progenitoras neuronais.

Por exemplo, apenas neurônios glutamatérgicos serão transfectados usando este método. Além disso, podemos eletroorar em estágios embrionários iniciais e atingir neurônios da camada mais profunda nascidos precocemente, ou podemos eletrolíticos em estágios posteriores de desenvolvimento e direcionar neurônios nascidos mais tarde que são destinados a camadas mais superficiais do córtex. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do neurodesenvolvimento.

Por exemplo, como os fatores intrínsecos e extrínsecos interagem para afetar o crescimento neurológico e a ramificação? Embora esse método possa fornecer informações sobre o crescimento do processo neuronal, ele também pode ser aplicado a outros processos de neurodesenvolvimento, como sinaptogênese, proliferação celular e determinação de sulfato. Prepare uma agulha de injeção conforme descrito no texto que acompanha o artigo.

Evitando bolhas, preencha a agulha com DNA expressando GFP e o gene de interesse inclui verde rápido Para visualizar as injeções, carregue o espaço restante na agulha com óleo de milho. Anexe um pico spritzer à agulha carregada para controlar as injeções. Exponha os chifres uterinos de uma rata grávida anestesiada, conforme descrito anteriormente.

E no texto que acompanha este vídeo de injeção de embriões E 15 é mostrado aqui. Identifique o local da injeção iluminando os embriões com uma lâmpada pescoço de ganso. Manipule suavemente um embrião para descobrir onde está a cabeça e localizar a sutura da linha média.

Use isso como um ponto de referência para encontrar o ventrículo lateral. Injete DNA através da parede uterina e no ventrículo lateral. Injete vários pulsos no ventrículo até que este seja preenchido com DNA.

O vetor determinado pela colocação dos eletrodos é fundamental para determinar qual região do neocórtex é eletroporada. Aqui, o eletrodo positivo é colocado próximo às posições dorsais mediais ao longo do cérebro para atingir essa região do prosencéfalo. A colocação alternativa dos eletrodos terá como alvo outras regiões do córtex, incluindo o fluxo cortical lateral.

Injete e eletropore cada embrião. Por sua vez, retorne os cornos uterinos à cavidade corporal e feche a incisão. Monitore os animais enquanto eles se recuperam da anestesia.

Aqui, os animais são colhidos para cultivo 24 horas após a eletroporação, para que a GFP seja detectável. Remova os embriões do útero do rato sacrificado e coloque-os em uma placa de Petri cheia de HBSS gelado com cátion divalente em uma capela de fluxo de lâmina. E sob um microscópio de dissecação fluorescente, use uma pinça dumont número cinco.

Para dissecar os córtices. Use uma pinça dumont tamanho número três para remover as meninges, ligue a fluorescência usando uma tesoura val. Corte as regiões positivas de GFP do tecido.

Transfira essas peças para um tubo cônico de 50 mililitros cheio de HBSS gelado sem cátion divalente. Colete todas as peças positivas GFP no tubo. Remova o HBSS do tubo e substitua-o por um mililitro de solução de EDTA de 0,25% de tripsina misturada suavemente por incubadora de inversão a 37 graus Celsius por cinco minutos.

Remova a solução de tripsina. Substitua-o por entre um e cinco mililitros de meio de revestimento para depender da quantidade de tecido positivo para GFP. Usando uma pipeta de stripette de dois mililitros, comi de cinco a sete vezes para dissociar as células.

Conte as células usando um hemocitômetro diluído com meio de plaqueamento até uma concentração de dois a 3,5 vezes 10 elevado a cinco células por 1,5 mililitro de placa média de 1,5 mililitros em cada câmara de uma câmara revestida CC dois. Deslizar. Incube as células a 37 graus Celsius por quatro horas para permitir que as células adiram às lâminas. O meio aspirado apresentou 1,5 mililitros de meio neuronal por cultura em câmara.

As células a 37 graus Celsius até o estágio desejado antes de prosseguir com a imunocoloração. Para medições do processo neuronal. A cultura do tempo de crescimento varia entre 24 horas e sete dias.

Aspirar o meio de cada câmara de cultura numa hotte. Fixe as células com 4% de formaldeído por 15 minutos. Lave duas vezes rapidamente com uma vez PBS antes de bloquear e imuno visto nas culturas, conforme detalhado no texto anexo, monte as culturas com meio de montagem fluorescente e uma lamínula.

Visualize as culturas a 20 x sob um microscópio fluorescente. Registre imagens de neurônios positivos para GFP para análise. Descobrimos que, com essa técnica, aproximadamente 75% dos cérebros eletroporados são direcionados para a região desejada do córtex, seja o córtex medial dorsal ou o córtex lateral ventral.

Encontramos eletroporação precoce em E 13 a 14 neurônios alvo da camada profunda, como TBR, uma camada positiva, seis neurônios, enquanto a eletroporação posterior alvo CT IP, dois TBR positivo, uma camada negativa, cinco células, ainda mais tarde, eletroporação alvo BRN duas camadas positivas, duas barras três células. Aqui mostramos seções coronais de cérebros eletroporados no dia embrionário 15,5 ou 17,5 e colhidos no quinto dia pós-natal. Em cultura, a porcentagem de células que A GFP positivo pode variar amplamente, dependendo de quão conservador você é ao dissecar a região positiva para GFP.

No entanto, mesmo quando somos muito conservadores e dissecamos apenas o patch de células positivo para GFP, a porcentagem mais alta que observamos é de cinco a 10% Essa baixa eficiência de transfecção é útil para identificar quais processos pertencem à célula eletroporada que você está analisando. O plaqueamento de células nessa densidade mais alta contribui para ter culturas mais saudáveis. No entanto, é difícil discernir qual processo pertence a qual corpo celular nas células GFP negativas.

Após este procedimento, a imunocoloração pode ser realizada para vários marcadores diferentes, a fim de responder a perguntas sobre proliferação, sinaptogênese e determinação de sulfato. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar reagentes e ferramentas estéreis para evitar contaminação e infecção Uma vez dominado. Cada aspecto dessa técnica pode ser realizado em duas a três horas, se executado corretamente.

Então é isso. Obrigado por assistir. Boa sorte com seus experimentos.