Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Nossa experiência visual começa quando o pigmento visual em nossos fotorreceptores retinianos absorve fótons de energia luminosa, levando ao fechamento de canais dependentes de nucleotídeos cíclicos na membrana celular. Isso suprime a liberação do neurotransmissor glutamato de bastonetes e cones. O glutamato liberado é detectado pelas células retinianas a jusante para estudar os sinais a jusante.

Os olhos são removidos de um camundongo sacrificado. Os S são isolados, embutidos em um bloco de ágar e fatiados usando um micrótomo vibratório. Em seguida, as fatias da retina são colocadas sob um microscópio e estimuladas com iluminação LED.

Enquanto as gravações de patch clamp são feitas para medir as correntes sinápticas ou potenciais gerados. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades devido às complexidades adicionais de trabalhar no escuro. Portanto, ser capaz de visualizar todo o processo proporcionará uma sensação difícil de descrever.

Comece este procedimento revestindo os eletrodos de fio de registro e referência que serão usados com uma camada de cloreto de prata. Mergulhe os eletrodos em um cloreto de sódio molar. Em seguida, usando uma fonte de alimentação de 15 volts com uma onda senoidal de um hertz, dirija 15 volts entre eles por cerca de 20 segundos.

Usando um extrator de micropipeta, prepare pipetas de vidro de sílica BO polido a fogo, escolhendo uma resistência da ponta da pipeta com base no tamanho das células-alvo para corpos celulares com cerca de 20 mícrons de diâmetro. Use um tubo PET com uma resistência de ponta de cinco a 10 mega ohms para corpos celulares. Após cerca de cinco mícrons de diâmetro, use uma resistência de ponta de 12 a 15 mega ohms.

Para preparar os eletrodos de referência de aterramento, use uma seringa para encher o tubo de polietileno com uma solução de ágar 3,5% preparada em um cloreto de sódio milimolar. Em seguida, prepare as seguintes soluções de acordo com as instruções do protocolo escrito que o acompanha. Solução de banho externo solução de fatiamento, solução interna de pipeta de aspartato de potássio e o batente de ágar.

Armazene todas as soluções a quatro graus Celsius até que sejam necessárias. No dia do experimento, Thor cerca de 1,5 mililitros de solução interna de aspartato de potássio. Em seguida, adicione o flúor diluído.

Despeje cerca de 50 mililitros de meios de mira contendo bicarbonato de sódio no recipiente de armazenamento leve e hermético. Conecte o tubo de plástico a um tanque de gás contendo 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio para equilibrar o meio de mira com o gás e, em seguida, coloque o recipiente em um banho-maria de 30 a 32 graus Celsius. Em seguida, encha uma garrafa com 110 mililitros de pontas, médio contendo as ervilhas e coloque-o no gelo.

Iguale o meio borbulhando a solução com gás oxigênio a 100%. Coloque o meio aimes restante contendo bicarbonato de sódio em um reservatório aquecido em cima da gaiola de Faraday. Enrole a paraforma ao redor da tubulação e da tampa do frasco para reter o gás no espaço acima da solução e equilibre com 5% de dióxido de carbono e 95% de gás oxigênio.

Usando um tubo de dispersão de ar de vidro, prepare 3% de baixa temperatura de gelificação de aros adicionando 0,75 gramas a 25 mililitros de miras médias com muito calor. A solução é de cerca de 115 graus Celsius enquanto mexe. Quando a solução ficar límpida sem bolhas, coloque a solução de ágar derretido em banho-maria a 42 graus Celsius.

Configure a câmara de registro no microscópio invertido. Deslize uma ponte de ágar de cinco centímetros sobre o eletrodo de referência de cloreto de prata e posicione-o na câmara de registro. A resistência da ponta da pipeta pode ser medida enchendo uma pipeta com solução interna, colocando-a no porta-pipeta, colocando o porta-pipeta no estágio da cabeça do amplificador e abaixando a pipeta em solução para preservar o pigmento visual para registros fisiológicos, todos os procedimentos devem ser realizados sob luz infravermelha usando óculos infravermelhos, mas todos os procedimentos serão mostrados aqui na luz ambiente.

Depois que o mouse for sacrificado, use uma tesoura curva para remover rapidamente os olhos. Coloque os olhos em um pedaço de papel de filtro para evitar que rolem. Em seguida, segure um olho no lugar com uma pinça e use uma lâmina fina de dupla face para fazer um corte na córnea.

Assim que o globo ocular for perfurado. Transfira o olho para uma placa de Petri de 60 milímetros cheia de miras médias. Usando a fenda na córnea como ponto de entrada, use uma tesoura pequena para cortar as partes restantes da córnea.

Em seguida, remova a lente e o humor vítreo, garantindo que a retina permaneça presa à ocular. Coloque-o em um recipiente leve e apertado cheio de pontas. Meio equilibrado com 5% de dióxido de carbono em 95% de oxigênio a 32 graus Celsius.

Próximo hemis sec. Uma das oculares usando uma lâmina de bisturi número 10. Separe a retina do epitélio pigmentar da retina.

Remova as bordas da retina para permitir que o tecido fique plano. Use uma pequena pipeta de macarrão de vidro com um bulbo de látex para encher uma placa de Petri de 35 milímetros com ágar derretido de baixa temperatura de gelificação e arraste a pinça pelo ágar para testar sua consistência. Assim que o ágar começar a solidificar, transfira a retina para o topo do ágar.

Em seguida, sem tocar na retina, use um pedaço torcido de lenço umedecido para absorver o excesso de solução ao redor. Coloque mais duas a três gotas de ágar diretamente na retina e coloque rapidamente um cilindro de plástico para formar uma parede ao redor dele, mantendo a retina perto do centro do cilindro, goteje em ágar derretido adicional, transfira a placa de Petri para um banho de água gelada para esfriar. Após 30 segundos, remova o tecido e use um êmbolo para extrudar o bloco de ágar, empurrando do lado mais distante da retina.

Use uma lâmina de barbear unilateral para cortar um pequeno bloco de ágar contendo a retina e cole o bloco no lugar contra o batente de ágar no disco de amostra. Transfira o disco de amostra para a árvore de micrótomo vibratório e despeje pilhas de miras geladas na árvore, permitindo que o bloco com a retina fique totalmente submerso. Corte fatias de retina com uma espessura de cerca de 200 mícrons usando a taxa máxima de vibração da lâmina com uma velocidade de lâmina para frente definida de forma que leve de quatro a cinco segundos para cortar a retina. Uma vez.

Use uma lâmina de bisturi número 11 para cortar cada fatia utilizável do bloco, uma de cada vez. Coloque as fatias contendo a retina em câmaras de gravação e segure-as. Usando âncoras de fatia, os fios de nylon cruzam a âncora de fatia.

Segure o ágar ao redor da retina, deixando-a desobstruída. Para gravações. Transfira a câmara de registro para o estágio do microscópio vertical.

Feche a cortina e ligue a fonte de luz infravermelha para visualizar a fatia em uma câmera sensível ao infravermelho. Ao microscópio, identifique uma fatia de retina com fotorreceptores intactos no ângulo de corte apropriado. Alguns danos na superfície podem ser aparentes devido ao processo de fatiamento.

Usando uma pipeta com a ponta quebrada, suga suavemente os corpos de células mortas Para remover essa fina camada de células, uma vez que uma camada saudável de células vivas tenha sido revelada, identifique um corpo celular cuja posição esteja localizada nos estratos de interesse. Mova a ponta da pipeta de forma que ela faça uma covinha na membrana celular e aplique uma pressão suave, negativa ou interna para fazer uma vedação de alta resistência. O modo de célula inteira pode ser alcançado aplicando pressão negativa ao eletrodo para entrar na célula.

Em seguida, estimule o tecido retiniano com luz usando LEDs para evocar respostas. No final da gravação, capture uma imagem usando a luz de excitação apropriada para o flúor que dialisou na célula a partir da solução interna da pipeta. Aqui, são mostrados potenciais evocados pela luz de um neurônio retiniano adaptado ao escuro a flashes de luz de força crescente.

Esta figura é uma imagem de fluorescência tirada de uma fatia de retina onde as células foram preenchidas com a fluorescência evocada amarela de Lúcifer Fluor mostra a morfologia das células a partir das quais as gravações de patch foram feitas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma melhor compreensão de algumas das complexidades de fazer gravações de patch clamp a partir de fatias de retina adaptadas ao escuro. O objetivo deste procedimento é medir as respostas evocadas pela luz sob iluminação controlada.

Para fazer isso, temos que primeiro isolar a retina, incorporá-la no sem-fim e, em seguida, preparar fatias de retina a partir das quais podemos fazer gravações de células únicas.