Name: Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a realizar gravações de patch clamp em neurônios da retina de camundongo em preparações de fatias escurecidas. Este método permite estudar vias de sinalização celular após estimulação luminosa.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant EY17606 (APS).

1. Eletrodos preparar <ol><li> Preparar os eletrodos de registro e referência por imersão-los tanto em NaCl 1M e dirigir 15V entre eles usando uma onda senoidal 1 Hz ~ 20 para s. </li><li> Fazer a gravação usando eletrodos de um puxador de micropipeta (Sutter Instruments P-97). Para patch-pipetas usar um vidro de borosilicato com um diâmetro exterior de 1,2 mm e um diâmetro interno de 0,69 mm (Sutter Instruments, Cat # B120-69-10). Medir a resistência em série com a ponta do eletrodo. Com base no tamanho das células-alvo escolher uma ponteira de diâmetro, por corpos celulares ~ 20 mM em uso diâmetro ~ 5 mohms de corpos celulares ~ 5 mm de diâmetro em uso ~ 12 mohms. </li><li> Prepare solo / eletrodos de referência. Usando uma seringa encher um tubo de polietileno pequena seção (Intramedic, PE205) com 1 mM NaCl que inclui Agar 3,5% (Sigma; Cat # A7002) em NaCl 1M. Coloque esta ponte agar sobre o eletrodo de referência Ag / AgCl. </li></ol> 2. Soluções preparar <ol><li> Solução de banho externo, "a mídia contendo bicarbonato (1 L): 1 garrafa de Ames 'Ames Médio (Sigma; Cat # A1420), 1,9 g de NaHCO 3, 7 mL de penicilina-estreptomicina (Sigma; Cat # P0781) para evitar bacteriana crescimento. Ajuste osmolaridade para ~ 280 mOsm. </li><li> Corte solução, "a mídia contendo o HEPES pH tampão (1 L): 1 garrafa de Ames 'Ames Médio, 0,887 g de NaCl, 2,38 g de HEPES, 7 mL de penicilina-estreptomicina. Ajustar o pH a 7,4 com 1M ~ NaOH e / ou 1M HCl. Ajuste osmolaridade para ~ 280 mOsm. </li><li> Aspartato de potássio (K-Asp) pipeta solução interna (em mM): 125 K-aspartato, 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0,5 CaCl 2, 1 ATP-Mg, 0,2 GTP-Mg, pH é ajustado para ~ 7.3 com NMG-OH, e osmolaridade é ajustada a ~ 280 mOsm. </li><li> Recuo Agar para estabilizar a temperatura baixa gelificação agarose contendo a retina (5% em peso), 7,5 g de Agar (Sigma; Cat # A7002) derretido em 150 ml de dH 2 O. </li></ol> 3. Dia da Experiência <ol><li> Descongelar ~ 1,5 mL de K-Asp Solução Interna e do fluoróforo de sua escolha a partir de freezer. Diluir o fluoróforo à concentração adequada, que deve ser determinada empiricamente. </li><li> Despeje media Ames 'contendo NaHCO 3 (~ 200 mL) para o recipiente de armazenamento à prova de luz e coloque em banho-maria (30-32 ° C) e equilibrar com 5% de CO 2 / 95% O 2 gás </li><li> Preencha frasco com 110 mL ~ dos meios de comunicação de Ames contendo HEPES, colocar no gelo e se equilibram com 100% de O 2. </li><li> Coloque o restante Ames 'mídia contendo NaHCO 3 em um reservatório aquecido em cima da gaiola de Faraday, e se equilibram com 5% de CO 2 / O 2 95% de gás. Parafilme podem ser usados ​​para prender o gás no espaço acima da solução. </li><li> Prepare a baixa temperatura de gelificação agarose (3%) pela adição de 0,75 g (Sigma; Cat # A0701) a 25 mL dos meios de comunicação de Ames com HEPES e aquecer a solução em ~ 115 ° C para derreter a agarose. Mexa até que a solução clara, sem bolhas, e armazenar em um banho de água (~ 42 ° C). </li><li> Preencha uma pipeta de gravação com a solução de K-Asp internos e verificar a resistência de ponta. </li></ol> 4. Experimente começar <ol><li> Euthanize o mouse e rapidamente remover os olhos com uma tesoura curva. Óculos infravermelhos deve ser usado para todos os procedimentos para prevenir branqueamento do pigmento visual. </li><li> Coloque os olhos em um pedaço de papel de filtro para os impedir de rolamento, e usando uma lâmina de dupla face fina, fazer uma fenda na córnea, mantendo o olho com a pinça. </li><li> Tão logo o globo ocular é perfurada, a transferência que olho em um prato cheio com a mídia de Ames. </li><li> Usando a régua na córnea como um ponto de entrada, tesoura pequena são usados ​​para cortar as porções restantes da córnea, após o qual a lente e vítreo pode ser removido. Tenha cuidado para que a retina permanece preso à ocular, e armazenar a ocular no escuro a 32 ° C nos meios de comunicação equilibrada com 5% de CO 2 / 95% O 2 Ames. </li></ol> 5. Corte <ol><li> Hemisect uma das oculares e dissociar a retina do epitélio pigmentar da retina. Retire as bordas da retina para permitir que o tecido para ficar na posição horizontal. </li><li> Use um pequeno vidro pipeta Pasteur com um bulbo de látex para preencher uma 35 milímetros placa de Petri com agar derretido, e arraste a pinça através através do ágar para testar a sua consistência. </li><li> Quando você pode começar a ver o ágar solidificar: <ol class="lalpha"><li> Transferência da retina para o topo do ágar. </li><li> Use um pedaço torcido de Kimwipe para absorver o excesso de solução em torno da retina. </li><li> Coloque 2-3 gotas de Agar diretamente na retina e rapidamente colocar um cilindro de plástico sobre a retina para formar uma parede em torno dela. Então por gotejamento agar derretido adicionais abaixo dos lados do cilindro de plástico, enquanto centrando a retina dentro do ágar. </li><li> Transferir o prato Petri to banho de água gelada para esfriar. </li></ol></li><li> Depois de ~ 45 segundo remover o tecido do banho-maria de gelo e use um êmbolo para expulsar o ágar bloco para fora do cilindro de plástico, empurrando a partir do lado mais distante da retina. </li><li> Use a lâmina de um lado para cortar um pequeno bloco de ágar contendo a retina e superglue o bloco no lugar contra o recuo de ágar no disco espécime. </li><li> Transferência do disco de amostra para a bandeja micrótomo vibrando e despeje HEPES gelada Ames na bandeja permitindo que o bloco com retina para ser totalmente submerso. </li><li> Fatias da retina com uma espessura de ~ 200 mM pode ser cortado à taxa máxima de lâmina de vibração e uma velocidade de lâmina para a frente esse conjunto que leva de 4 a 5 segundos para cortar a retina em cada fatia. </li><li> Use uma lâmina de bisturi n º 11 para remover cada uma fatia útil de cada vez </li><li> Fatias bom contendo retina são colocados em câmaras de gravação e são sobrecarregados com âncoras fatia com fios de nylon cruzá-los. Os fios de nylon mantenha o agar em torno da retina, deixando a retina desobstruídas para as gravações. </li><li> Transferência da câmara de gravação para o estágio do microscópio na posição vertical, fechar a cortina e ligar a fonte de luz infravermelha para ver a fatia em uma câmera infravermelha e minúsculas. </li></ol> 6. Gravação <ol><li> Uma vez que uma fatia boa da retina (com fotorreceptores intactas e do ângulo de corte adequado) é identificado começar a perfusão da retina a uma taxa superior a 5 mL / min com a mídia Ames aquecida ", que é aquecida a 35 ° C e 37 equilibrada com 5% de CO 2 / 95% O 2. </li><li> Alguns danos na superfície pode ser aparente devido ao processo de corte. Esta camada fina de células geralmente pode ser removido com uma pipeta com uma ponta quebrada, e gentilmente sugando os corpos de células mortas. Este será tipicamente revelam células vivas embaixo. Identificar um corpo da célula saudável, cuja posição está localizado nos estratos de interesse. </li><li> Preencher uma micropipeta com a solução KAsp interna e aplicar pressão (para fora) positiva através da ponta da pipeta, e inferior a ponta da pipeta na câmara de gravação e para baixo ao nível da célula usando um micromanipulador. </li><li> Mova a ponta da pipeta de tal forma que as covinhas da membrana celular, e aplicar pressão suave (para dentro) negativa a fazer um selo de alta resistência. De célula inteira modo pode ser alcançado através da aplicação de pressão negativa para o eletrodo para invadir a célula. </li><li> Estimular o tecido da retina usando LEDs podem evocar respostas à luz. </li><li> Fotografia da célula a partir do qual a gravação foi feita evocando fluorescência do fluoróforo na solução da pipeta interna. </li></ol> 7. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Aqui, a luz-potenciais evocados de um dark-adaptados neurônio da retina para flashes de luz de aumentar a força são mostrados. <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Imagem de fluorescência de uma fatia da retina onde as células foram preenchidas com o fluoróforo, Lucifer Yellow. Fluorescência evocado mostra a morfologia das células a partir do qual foram feitas as gravações de patch.

<ol><li>Weblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> J Physiol. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connections+among+retina+neurons+in+living+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Synaptic connections among retina neurons in living slices.</a> J Neurosci Methods. 20, 139-149 (1987).</li>
<li>Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+contrast+adaptation+in+salamander+bipolar+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal contrast adaptation in salamander bipolar cell.</a> J Neurosci. 21, 9445-9454 (2001).</li>
<li>Armstrong-Gold, C., &amp, R. ieke, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bandpass+filtering+at+the+rod+to+second-order+cell+synapse+in+salamander+%28Ambystoma+tigrinum%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bandpass filtering at the rod to second-order cell synapse in salamander (Ambystoma tigrinum) retina.</a> J Neurosci. 23, 3796-3806 (2003).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li>
<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Gravação fatia de retinas vertebrados têm sido feitas há décadas 1,2, e têm sido bastante bem sucedidos em fornecer uma compreensão mais profunda de como o circuito da retina codifica luz incidente. As vantagens do corte em micrótomo vibrando em vez de diretamente com uma lâmina de barbear é que as fatias da retina incorrer menos danos na superfície. Com uma pipeta de sucção é fácil de remover esse dano e células-alvo saudável logo abaixo da superfície que possuem conectividade no circuito da retina, onde a m...

<table><tbody><tr><td>Puxador de micropipetas</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vidro borossilicato</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>Intramedic</td><td>PE205</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td></td></tr><tr><td>Agarose com baixa temperatura de gelificação</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Ames&amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr></tbody></table>

remendo recordings grampo de neurônios da retina do rato em um preparação slice dark-adaptados

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Nossa experiência visual é iniciada quando o pigmento visual em nossa fotorreceptores da retina absorve fótons de energia luminosa e inicia uma cascata de eventos intracelulares que levam ao encerramento do cíclica de nucleotídeo-gated canais na membrana da célula. A mudança resultante no potencial da membrana leva, por sua vez a redução na quantidade de liberação de neurotransmissores dos dois rod e terminais de cone sináptica. Para medir o quanto a mudança de luz evocada em fotorreceptoras potencial de membrana leva a atividade a jusante na retina, os cientistas fizeram gravações eletrofisiológicas das preparações fatia da retina para 1,2 décadas. No passado, essas fatias foram cortadas manualmente com uma lâmina de barbear no tecido da retina que é anexado ao papel de filtro; nos últimos anos um outro método de corte tem sido desenvolvida através do qual o tecido da retina é incorporado em agar baixa temperatura de gelificação e cortados em solução legal com um vibrando micrótomo 3,4. Esta preparação produz fatias da retina com menos danos superficiais e muito robusto respostas luz evocado. Aqui nós documento como esse procedimento pode ser feito sob a luz infravermelha para evitar a descoloração do pigmento visual.

Aqui nós descrevemos um procedimento para a geração de adaptação ao escuro fatias da retina do rato para gravações eletrofisiológicas.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Nossa experiência visual é iniciada quando o pigmento visual em nossos fotorreceptores retinianos absorve fótons de energia luminosa e inicia uma cascata de...

Nossa experiência visual começa quando o pigmento visual nos fotorreceptores da retina absorve fótons de energia luminosa, levando eventualmente ao fechamento de canais ativados por nucleotídeos cíclicos na membrana celular. Isso suprime a liberação do neurotransmissor glutamato tanto por bastonetes quanto por cones. O glutamato liberado é detectado por células retinianas downstream para o estudo dos sinais subsequentes.Os olhos são removidos de um camundongo eutanasiado. Os S são isolados, embutidos em um bloco de ágar e cortados utilizando um micrótomo vibratório. Em seguida, os cortes retinianos são colocados sob um microscópio e estimulados com iluminação por LED.Enquanto os registros de patch clamp são realizados para medir as correntes ou potenciais sinápticos gerados, geralmente indivíduos novos nesse método enfrentam dificuldades devido às complexidades adicionais de trabalhar no escuro. Assim, poder visualizar todo o processo proporcionará uma sensação que, de outra forma, seria difícil de descrever.Inicie este procedimento revestindo os eletrodos de fio de gravação e de referência que serão utilizados com uma camada de cloreto de prata. Mergulhe os eletrodos em cloreto de sódio um molar. Em seguida, utilizando uma fonte de alimentação de 15 volts com uma onda senoidal de um hertz, aplique 15 volts entre eles por cerca de 20 segundos.Usando um puxador de micropipetas, prepare pipetas de patch a partir de vidro de sílica BO polido a fogo, escolhendo uma resistência da ponta da pipeta com base no tamanho das células-alvo para corpos celulares com cerca de 20 mícrons de diâmetro. Utilize uma pipeta com resistência da ponta entre cinco e 10 megaohms para corpos celulares. Após cerca de cinco mícrons de diâmetro, use uma resistência da ponta entre 12 e 15 megaohms.Para preparar os eletrodos de referência de terra, use uma seringa para encher tubos de polietileno com uma solução de ágar a 3,5% preparada em cloreto de sódio de um milimolar. Em seguida, prepare as seguintes soluções de acordo com as instruções no protocolo escrito anexo. Solução externa de banho, solução de corte, solução interna da pipeta de aspartato de potássio e o suporte traseiro de ágar.Armazene todas as soluções a quatro graus Celsius até o momento de utilizá-las. No dia do experimento, retire cerca de 1,5 mililitros de solução interna de aspartato de potássio. Em seguida, adicione Fluor diluído.Despeje cerca de 50 mililitros de meio aims contendo bicarbonato de sódio no recipiente de armazenamento opaco à luz. Conecte a tubulação de plástico a um tanque de gás contendo 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio para equilibrar o meio aims com o gás e, em seguida, coloque o recipiente em um banho-maria a 30 a 32 graus Celsius. Em seguida, encha um frasco com 110 mililitros do meio aims contendo he pas e coloque-o sobre gelo.Iguale o meio borbulhando a solução com gás oxigênio a 100%. Coloque o meio aimes restante contendo bicarbonato de sódio em um reservatório aquecido sobre a gaiola de Faraday. Envolva o tubo e a tampa da garrafa com parafina para aprisionar o gás no espaço acima da solução e equilibrar com gás carbônico a 5% e oxigênio a 95%.Usando um tubo de dispersão de ar de vidro, prepare 3% de agarose de baixa temperatura de gelificação adicionando 0,75 gramas a 25 mililitros de meio aims com aquecimento intenso. A solução atinge cerca de 115 graus Celsius durante a agitação. Quando a solução ficar límpida e sem bolhas, coloque a solução de agarose fundida em um banho-maria a 42 graus Celsius.Monte a câmara de gravação no microscópio invertido. Deslize uma ponte de ágar de cinco centímetros sobre o eletrodo de referência de prata, cloreto de prata e posicione-a na câmara de gravação. A resistência da ponta do micropipeta pode ser medida preenchendo-se uma micropipeta com solução interna, colocando-a no suporte do micropipeta, posicionando o suporte no estágio de cabeçote do amplificador e abaixando a micropipeta na solução; para preservar o pigmento visual durante as gravações fisiológicas, todos os procedimentos devem ser realizados sob luz infravermelha utilizando óculos de infravermelho, mas todos os procedimentos serão mostrados aqui sob luz ambiente.Após a eutanásia do camundongo, use uma tesoura curva para remover rapidamente os olhos. Coloque os olhos sobre um pedaço de papel de filtro para impedir que rolem. Em seguida, segure um olho no lugar com uma pinça e use uma lâmina fina de dupla face para fazer um corte na córnea.Assim que o globo ocular for perfurado, transfira o olho para uma placa de Petri de 60 milímetros cheia com meio aims. Usando o corte na córnea como ponto de entrada, utilize uma tesoura pequena para remover as porções restantes da córnea.Em seguida, remova o cristalino e o humor vítreo, garantindo que a retina permaneça aderida à cúpula ocular. Coloque-a em um recipiente opaco à luz, preenchido com meio AMS equilibrado com 5% de dióxido de carbono em 95% de oxigênio a 32 graus Celsius.Em seguida, corte o hemisfério secundário de uma das cúpulas oculares usando uma lâmina de bisturi número 10. Separe a retina do epitélio pigmentado da retina.Remova as bordas da retina para permitir que o tecido fique plano. Use uma pipeta de vidro pequena para massas com uma bolsa de látex para encher uma placa de Petri de 35 milímetros com ágar fundido de baixa temperatura de gelificação e arraste a pinça através do ágar para testar sua consistência. Assim que o ágar começar a solidificar, transfira a retina para o topo do ágar.Em seguida, sem tocar na retina, use um pedaço de papel absorvente torcido para absorver a solução em excesso ao redor dela. Coloque duas a três gotas adicionais de ágar diretamente sobre a retina e rapidamente posicione um cilindro de plástico para formar uma parede ao seu redor, mantendo a retina próxima ao centro do cilindro; acrescente mais ágar derretido gota a gota, transfira a placa de Petri para um banho de gelo com água para resfriar. Após 30 segundos, retire o tecido e use um êmbolo para extrudir o bloco de ágar, empurrando a partir do lado mais distante da retina.Use uma lâmina de barbear de um lado para recortar um pequeno bloco de ágar contendo a retina e fixe o bloco com cola instantânea contra o anteparo de ágar no disco de espécime. Transfira o disco de espécime para o suporte do microtomo vibratório e despeje abundantemente solução AIM gelada no suporte, deixando o bloco com a retina completamente submerso. Corte fatias da retina com espessura de cerca de 200 mícrons usando a taxa máxima de vibração da lâmina e uma velocidade de avanço da lâmina ajustada de modo que leve de quatro a cinco segundos para cortar completamente a retina.Use uma lâmina de bisturi número 11 para cortar cada fatia utilizável do bloco, uma de cada vez. Coloque as fatias contendo a retina em câmaras de registro e fixe-as. Usando os suportes para fatias, os fios de náilon cruzam o suporte para fatias.Segure o agar ao redor da retina, deixando a retina desobstruída. Para gravações. Transfira a câmara de gravação para a platina do microscópio ereto.Feche a cortina e ligue a fonte de luz infravermelha para visualizar o corte em uma câmera sensível ao infravermelho. Sob o microscópio, identifique um corte retiniano com fotorreceptores intactos no ângulo de corte apropriado. Algum dano superficial pode ser evidente devido ao processo de corte.Usando uma pipeta com a ponta quebrada, aspire suavemente os corpos celulares mortos. Para remover essa camada fina de células, uma vez revelada uma camada saudável de células vivas, identifique um corpo celular cuja posição esteja localizada na camada de interesse. Mova a ponta da pipeta de modo que ela afunde levemente a membrana celular e aplique pressão negativa ou interna suave para formar um selo de alta resistência. O modo de célula inteira pode ser alcançado aplicando-se pressão negativa ao eletrodo para romper a célula.Em seguida, estimule o tecido retiniano com luz utilizando LEDs para evocar respostas. Ao final da gravação, capture uma imagem usando a luz de excitação apropriada para o Fluor que se difundiu para dentro da célula a partir da solução interna da pipeta. Aqui, são mostrados os potenciais evocados pela luz de um neurônio retiniano adaptado à escuridão em resposta a flashes de luz de intensidade crescente.Esta figura é uma imagem de fluorescência obtida a partir de um corte de retina no qual as células foram preenchidas com o corante Fluor Amarelo de Lucifer; a fluorescência induzida mostra a morfologia das células das quais foram realizados os registros em configuração de patch. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão mais clara de algumas das complexidades envolvidas na realização de registros com microeletrodo de adesão em cortes de retina adaptados à escuridão. O objetivo deste procedimento é medir respostas induzidas pela luz sob iluminação controlada.Para fazer isso, precisamos primeiro isolar a retina, embuti-la em ágar e, em seguida, preparar fatias retinianas das quais podemos obter gravações de células isoladas.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo mostra o processo de whole-cell recording voltagem clamp na fatia da retina do tigre aquáticos salamandra. Nós demonstramos a preparação da fatia, bem como a forma de realizar gravações patch clamp durante a estimulação visual da retina.

De célula inteira Recordings of Light Evocados Excitatórios Correntes Synaptic na Slice Retinal

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Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

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Estabelecendo um grampo de remendo de célula inteira para registro eletrofisiológico de uma retina de camundongo de montagem plana

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