Visualização de Larval Nervos segmentar em 3 ^Rd Instar Drosophila Preparações larval

O transporte axonal pode ser estudado por meio da visualização dos nervos segmentares larvais. Uma drosófila de terceiro estágio. Primeiramente, a larva é dissecada, expondo o SNC sem danificar os lobos ópticos, o gânglio ventral e os nervos segmentares.

O segundo passo do procedimento é fixar a larva em formaldeído antes de incubar com o anticorpo primário durante a noite e com o anticorpo secundário por uma hora no escuro. Em seguida, a larva é montada em uma lâmina de vidro para análise de defeitos no transporte axonal. A localização e a distribuição proteicas podem ser examinadas por meio de microscopia de imunofluorescência.

Embora este método possa fornecer informações sobre o transporte axonal, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a morfologia de sinapses e músculos. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois inicialmente é difícil realizar esta dissecação permitida, especialmente para manter os nervos segmentares cerebrais e os músculos intactos. Para iniciar este procedimento, prepare tampão de fixação para dissecação a uma vez, PBT a uma vez e solução de BSA a 5%.

Conforme detalhado na tabela apresentada anteriormente à dissecação, reúna um par limpo de pinças número cinco, um par limpo de tesouras retas em leque e alfinetes para iniciar a dissecação; use uma colher micro para coletar larvas vagantes em estágio estrela com um genótipo específico em uma placa de Petri. Em seguida, lave as larvas enxaguando-as em uma placa de Petri contendo água deionizada para remover todo o alimento.

Em seguida, coloque uma larva no prato de guarda S com o lado dorsal voltado para cima. Fixe a larva em sua extremidade anterior e posterior. Coloque uma gota do tampão de dissecação fresco sobre a larva fixada utilizando tesoura fina.

Pinça a larva na linha média dorsal próxima à extremidade posterior. Usando a tesoura, corte a cutícula da larva da extremidade posterior até a anterior. Coloque uma gota de tampão de dissecação novo e fresco sobre a larva dissecada.

Usando um alfinete, segure uma borda lateral da cutícula próxima ao meio da larva e fixe a cutícula com outro alfinete. Fixe a segunda borda lateral da cutícula, utilizando dois alfinetes em cada lado lateral, conforme mostrado no diagrama. Agora, remova cuidadosamente o intestino, os corpos gordurosos e o trato, deixando apenas o cérebro com os dois lobos ópticos e os gânglios ventrais.

Com os nervos segmentares fixados, realiza-se em seguida a fixação e a coloração com anticorpos, mantendo as larvas presas ao prato de guarda. Incube as larvas dissecadas em 50 microlitros de fixador durante 30 minutos. Após a fixação, substitua o fixador a cada 15 minutos e lave as larvas em PBT 1x durante 30 minutos.

Substituindo o tampão a cada 10 minutos, é importante observar que as larvas devem permanecer sempre submersas no tampão. Prepare a solução de anticorpo primário diluindo-o até a concentração apropriada na solução de BSA 5%. As concentrações ideais variam conforme o anticorpo.

Construa uma câmara úmida forrando um recipiente de plástico com papel-toalha umedecido em água. Substitua o papel anterior por PBT.

Lave com a solução de anticorpo primário preparada e incube na câmara úmida a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte. Lave as larvas dissecadas em PBT 1x por 30 minutos, substituindo o tampão a cada 10 minutos. Prepare o anticorpo secundário diluindo-o até a concentração apropriada na solução de BSA 5%.

E envolva a câmara úmida com papel alumínio, pois alguns anticorpos secundários são sensíveis à luz. Incube as larvas com a solução de anticorpo secundário a 25 graus Celsius por uma hora. Após a incubação com o anticorpo secundário, lave as larvas em PBT 1x durante 30 minutos, substituindo o tampão a cada 10 minutos, e prossiga para montar e visualizar as larvas dissecadas antes de montar a larva na lâmina.

Prepare o lâmina espalhando duas linhas verticais de esmalte no centro, com um espaço suficientemente grande para acomodar uma lamínula conforme mostrado no diagrama. Deixe o esmalte secar completamente. Quando o esmalte estiver seco, coloque uma gota de tampão de montagem no espaço entre as linhas verticais de esmalte na lâmina, conforme mostrado nesta imagem.

A lâmina agora está pronta para ser montada. Recupere as larvas após a última lavagem com PBT. Enxague e remova cuidadosamente os pinos laterais de uma larva.

Tenha cuidado para não rasgar a cutícula cuidadosamente. Remova os dois alfinetes restantes e pegue a larva com pinças, colocando-a sobre a lâmina preparada. Certifique-se de que a larva não esteja virada ao contrário e esteja orientada em posição ventral.

Com cuidado, coloque uma lamínula por cima e feche as bordas com esmalte conforme ilustrado aqui. As larvas estão agora prontas para visualização em um microscópio fluorescente. Esta imagem representativa é de uma larva do tipo selvagem corada com anticorpos contra a proteína da vesícula sináptica, proteína cysteine string.

Os nervos segmentares de lava são suavemente corados aqui. Um mutante da proteína motora lava foi corado com anticorpos contra CSP. Os nervos segmentares mostram acúmulos acentuados que se coram intensamente para CSP.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de preservar os nervos segmentares ligados ao cérebro e manter os músculos intactos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a dissecação. Fixe, em terceiro lugar, um imunomarcador e comece pelos nervos segmentares larvais para estudar o transporte axonal utilizando um microscópio fluorescente.