Name: Visualização de Larval Nervos segmentar em 3 Rd Instar Drosophila Preparações larval (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprenda a visualizar nervos segmentares larvais em Drosophila de terceiro instar usando microscopia de imunofluorescência. Este método permite estudar defeitos no transporte axonal e localização de proteínas em neurociência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SG é apoiado por fundos da Universidade Estadual de Nova York em Buffalo e de John R. Oishei Foundation.

1. Preparação dos Reagentes <ol><li> Prepare 1x tampão Dissecção com 128 mM NaCl, 4 mM CaCl 2, 4mm MgCl 2, 2 mM KCl, HEPES 5mM e Sacarose 36mm. PH da solução a 7,2 e filtro de esterilizar. </li><li> Prepare o fixador utilizando 01:01 diluição de formaldeído 16% e solução tampão 1x Dissection. </li><li> Prepare 1x PBT usando 1x Tampão fosfato salino (PBS) em um PH de 7,2 e Triton X-100 em uma proporção de 1:100. </li><li> Prepare 5% albumina sérica bovina (BSA) com 0,01% Na Azida em 1x PBS. </li></ol> 2. Preparação para o Dissection <ol><li> Sylgard pratos são usados ​​para dissecção. Prepare os pratos derramando Sylgard 184 base de elastômero de silicone de cura e agente de mistura em uma placa de Petri. Deixe a mistura solidificar completamente e seco antes de usar. </li><li> Antes da dissecação, reunir um par limpo de # 5 fórceps, um par de tesouras limpas lâmina reta Vannas, e pinos. </li></ol> 3. Dissecção de 3 larvas rd <ol><li> Coletar vagando 3 ª larvas de um genótipo específico em uma placa de Petri. </li><li> Lavar as larvas em água deionizada para se livrar da comida. </li><li> Coloque uma larva no prato Sylgard, com o lado dorsal. Pin a larva em suas extremidades anterior e posterior. </li><li> Colocar uma gota de tampão Dissection 1x na larva fixado. Usando uma tesoura fina beliscar a larva na linha média dorsal, perto da extremidade posterior. Usando a tesoura, cortar a cutícula larval da extremidade posterior até o final anterior. </li><li> Colocar uma gota de tampão Dissection nova 1x para a larva dissecados. Com um pino, pegar uma borda lateral da cutícula perto do meio da larva alfinete e da cutícula. Usando outro pino, o pino da borda lateral do segundo cutícula, como mostrado no diagrama. Dois pinos são usados ​​em cada lado lateral. Veja o diagrama abaixo. </li><li> Remova cuidadosamente os intestinos, órgãos de gordura, e traqueia, deixando apenas o cérebro com os dois lobos ópticos e gânglios ventral com os nervos segmentares anexado. O restante do procedimento é feito no prato Sylgard. </li></ol> 4. Fixação da Larva Dissecada <ol><li> Incubar a larva dissecada em correção para 30 minutos, substituindo a correção a cada 15 minutos. </li><li> Após a fixação, enxaguar a larva em 1x PBT por 30 minutos, substituindo o buffer a cada 10 minutos. É importante notar que a larva deve ser sempre em um buffer. </li></ol> 5. Coloração de anticorpos da Larva Dissecada <ol><li> Prepare o anticorpo primário, diluindo-lo para a concentração adequada em BSA 5% com azida em 1x Na PBT. Concentrações ideais serão diferentes para diferentes anticorpos. </li><li> Substituir a última 1x PBT enxaguar com a solução de anticorpos preparados primária, e incubar em câmara úmida a 4 ° C durante a noite. A câmara úmida é construído por um prato de revestimento de plástico com kim-limpa embebido em água. </li><li> No dia seguinte, lave a larva dissecados em 1x PBT por 30 minutos, substituindo o buffer a cada 10 minutos. </li><li> Prepare o anticorpo secundário, diluindo-o para a concentração adequada em BSA 5% com azida em 1x Na PBT, e incubar a larva com a solução de anticorpo secundário a 25 ° C por uma hora. Enrole a câmara úmida em folha para evitar a luz, como anticorpos secundários são sensíveis à luz. </li><li> Após a incubação, lavar a larva em 1x PBT por 30 minutos, substituindo o buffer a cada 10 minutos. </li></ol> 6. Montagem e visualização da Larva Dissecada <ol><li> Antes de montar a larva no slide, prepare o slide, espalhando duas linhas verticais de unha polonês no meio, com um espaço suficiente para uma cobertura de vidro para se sentar (ver diagrama). Deixe a unha polonês secar completamente. </li><li> Coloque uma gota de tampão de montagem no espaço entre as linhas verticais unha polonês no slide (ver diagrama). O slide está pronto para a montagem. <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.1.jpg" alt="Figura 1 passo 6.2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6,2 passo 1"> <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.2.jpg" alt="Figura 2 passo 6.2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura passo 2 6,2"></li><li> Após o último enxágüe 1x PBT, remova os pinos lateral. Tenha cuidado para não rasgar a cutícula. </li><li> Remova cuidadosamente os dois pinos restantes e pegue a larva com uma pinça e coloque a larva horizontalmente no slide preparado. Certifique-se que a larva não é capotou e é orientada lado ventral para cima. </li><li> Delicadamente, coloque uma lamínula em cima e feche as bordas com unha polonês (ver diagrama). A larva está agora pronto para visualização sob um microscópio fluorescente. <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.5.jpg" alt="Figura 1, passo 6.5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1 6.5 passo"></li></ol> 7. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: A imagem representativa da larval nervos segmentar a partir de um tipo selvagem larvum usando anticorpos contra a vesícula sináptica protéicas cadeia cisteína (CSP, Zinsmaier et al. 1994). Note-se que os nervos segmentares são suavemente manchado. Bar = 20Hm <img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: A imagem representativa da larval nervos segmentar a partir de uma larva mutante proteína motora utilizando anticorpos contra a proteína de vesícula sináptica proteína cadeia cisteína (CSP). Note-se que os nervos segmentares mostram acumulações maciças que mancha brilhante para CSP (setas).

<ol><li>Gunawardena, S., Goldstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Axonal+Transport+and+Neuronal+Viability+by+Amyoid+Precursor+Protein+Mutations+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila.</a> Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).</li>
<li>Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralysis+and+early+death+in+cysteine+string+protein+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila.</a> Science. 263, 977-980 (1994).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os nervos Drosophila larval segmentares são um poderoso sistema para estudar mecanismos de transporte axonal. Se o 3 º instar larval dissecção é realizada corretamente, todos os componentes do SNC, SNP e tecidos associados, tais como os músculos e NMJs, pode ser examinado dentro de uma larva único. Nós adaptamos este protocolo a partir do que foi publicado por Hurd e Saxton (1996). Este protocolo também pode ser adaptado para testar outros anticorpos neuronal, mas a otimização de anticorpos deve ser ...

<table><tbody><tr><td>Pinça Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinças Minutien, Aço Inoxidável</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Reta Mcpherson-Vannas, 8 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>50822236</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield, Meio de Montagem</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Elastômero de Silicone Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>4026148</td><td></td></tr><tr><td>formaldeído, 16%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>dCSP3</td><td>Banco de Híbridos para Estudos do Desenvolvimento</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Anti-Murino IgG de Cabra</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização de larval nervos segmentar em 3 rd instar drosophila preparações larval

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster está emergindo como um sistema poderoso modelo para estudar o desenvolvimento e função do sistema nervoso, particularmente por causa de sua genética e conveniente genoma completamente seqüenciado. Além disso, o sistema nervoso das larvas é um sistema modelo ideal para estudar mecanismos de transporte axonal como os nervos larval segmentar contêm feixes de axônios com seus corpos celulares localizados dentro do cérebro e os seus terminais terminação nervosa ao longo do comprimento do corpo. Aqui nós descrevemos o procedimento para a visualização de proteínas dentro das vesículas sinápticas larval nervos segmentares. Se feito corretamente, todos os componentes do sistema nervoso, juntamente com tecidos associados, tais como músculos e NMJs, permanecem intactas, não danificadas, e pronto para ser visualizado. 3 º larvas carregando várias mutações são dissecados, fixo, incubado com anticorpos das vesículas sinápticas, visualizados e comparados com larvas do tipo selvagem. Este procedimento pode ser adaptado para vários diferentes anticorpos synaptic ou neuronal e as mudanças na distribuição de uma variedade de proteínas pode ser facilmente observado dentro larval nervos segmentares.

Drosophila melanogaster larvas fornecer um modelo de sistema ideal para investigar os mecanismos de transporte axonal dentro larval nervos segmentares. Usando este procedimento, 3 de larvas portadores de mutações diferentes podem ser comparadas às larvas do tipo selvagem.

Visualização de Larval Nervos segmentar em 3 Rd Instar Drosophila Preparações larval

A *Drosophila melanogaster* está emergindo como um sistema modelo poderoso para estudar o desenvolvimento e a função do sistema nervoso, particularmente devido a...

O transporte axonal pode ser estudado por meio da visualização dos nervos segmentares larvais. Uma drosófila de terceiro estágio. Primeiramente, a larva é dissecada, expondo o SNC sem danificar os lobos ópticos, o gânglio ventral e os nervos segmentares.O segundo passo do procedimento é fixar a lava em formaldeído antes de incubar com o anticorpo primário durante a noite e com o anticorpo secundário por uma hora no escuro. Em seguida, a lava é montada em uma lâmina de vidro para análise de defeitos no transporte axonal. A localização e a distribuição proteicas podem ser examinadas por meio de microscopia de imunofluorescência.Embora este método possa fornecer informações sobre o transporte axonal, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a morfologia de sinapses e músculos. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois inicialmente é difícil realizar esta dissecação permitida, especialmente para manter os nervos segmentares cerebrais e os músculos intactos. Para iniciar este procedimento, prepare tampão de fixação para dissecação a uma vez, PBT a uma vez e solução de BSA a 5%.Conforme detalhado na tabela apresentada antes da dissecação, reúna um par

visualization-larval-segmental-nerves-3rd-instar-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos o procedimento para preparar...

Visualização do Sistema Nervoso embrionárias no Whole-mount Drosophila Os embriões

Este protocolo discute a dissecção ao vivo...

Em Visualization vivo das vesículas sinápticas Dentro Drosophila larval Axônios segmentar

Este protocolo descreve um método confiável para anestesiados e de imagem de...

Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

Um método para immunostain e visualizar os órgãos chordotonal em larvas e pupas...

Visualização de Propriocepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas e pupas

Este vídeo descreve a glândula anelar de Drosophila, uma estrutura endócrina complexa importante para a biossíntese e secreção de ecdisteróides e outros hormônios. O protocolo apresentado demonstra sua dissecção, fixação e imunocoloração.

Dissecção da glândula anelar larval: isolamento de órgãos endócrinos de desenvolvimento de Drosophila

Fonte: Jeong, S. Visualização do padrão de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a visualização de projeções axonais em embriões Drosophila. A imunomarcação de neurônios motores, a dissecção precisa para expor estruturas neuronais e a microscopia de contraste de interferência diferencial revelam coletivamente a arquitetura neuronal detalhada, enfatizando os padrões de projeção axonal.

Visualização de padrões de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila

Um paradigma lesão utilizando a Drosophila larval cordão nervoso ventral para investigar a regeneração do sistema nervoso central e de reparação é descrito. Stabbing seguido por varredura a laser microscopia confocal em amostras de lapso de tempo e fixa, combinada com a análise quantitativa, com software desenvolvido propositadamente e genética, são utilizados para investigar os mecanismos moleculares do CNS regeneração e reparo.

Um Paradigma para Investigar Lesão de reparação do sistema nervoso central em<em&gt; Drosophila</em

Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados.

Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

Nós descrevemos um protocolo para dissecação, fixação e imunocoloração de órgãos esteroidogênicas em Drosophila larvas e adultos do sexo feminino para estudar a biossíntese de hormônios esteróides e seu mecanismo de regulação. Em adição aos órgãos esteroidogênicas, podemos visualizar a inervação dos órgãos esteroidogênicas, bem como células alvo esteroidogênicas, tais como células estaminais da linha germinal.

Protocolos para a visualização de esteroidogênicas Órgãos e seus órgãos interativa com imunocoloração na mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este trabalho detalha um método de imuno-histoquímica padrão para visualizar as projeções de neurônios motores de embriões de Drosophila melanogaster em estágio final 16. A preparação em fileira de embriões fixos corados com anticorpo FasII fornece uma ferramenta poderosa para caracterizar os genes necessários para a identificação do axônio do motor e o reconhecimento do alvo durante o desenvolvimento neural.

Visualização do Padrão de Projeção Axonal de Neurônios de Motor Embrionários em<em&gt; Drosophila</em

Aqui, discutimos um fluxo de trabalho para preparar, dissecar, montar e obter imagens de cérebros de explantes vivos de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster para observar a dinâmica celular e subcelular sob condições fisiológicas.

Imagem de células vivas de cérebros de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster

Aprenda a visualizar nervos segmentares larvais em Drosophila de terceiro instar usando microscopia de imunofluorescência. Este método permite estudar defeitos no transporte axonal e localização de proteínas em neurociência.

Visualização de Larval Nervos segmentar em 3^Rd Instar Drosophila Preparações larval

Explorar mais vídeos