Indução e Avaliação de recombinação mudança de classe em purificada Células B murino

Durante a resposta imune humoral, as células B ativadas pelo antígeno proliferam e secretam anticorpos à medida que a resposta progride. O isotipo padrão de I GM é substituído pelos isotipos mais diversos IgG, IgA ou IgE para avaliar a proliferação e a troca de classe. Células B esplênicas são isoladas in vitro de um camundongo experimental utilizando separação magnética de células.

As células são coradas com o corante fluorescente CFSE para monitorar a proliferação, que é estimulada pelo tratamento com LPS bacteriano. O LPS também induz a troca de classe para o isotipo IgG3, que, juntamente com a proliferação, pode ser monitorada por citometria de fluxo. Hoje vou demonstrar uma técnica para o isolamento e ativação de linfócitos B esplênicos puros. Esta técnica pode ser utilizada para analisar a recombinação de troca de classe e a proliferação in vitro, além de poder responder a questões fundamentais no campo da imunidade de células B, incluindo a função e regulação da citidina desaminase induzida por ativação.

Comece por imergir um camundongo eutanasiado em etanol a 70%. O camundongo deve ter entre oito e 12 semanas de idade. Para garantir a completa maturação do sistema imunológico, utilize tesoura estéril para fazer uma incisão através da pele e do músculo da região hipocôndria esquerda do abdômen. Use tesoura ou pinça para remover o baço dos tecidos adjacentes.

Em seguida, corte-o em três partes grandes em PBS. Depois, usando a extremidade de borracha do êmbolo de uma seringa de um mililitro, esmague suavemente o baço através de uma peneira celular de 70 micrômetros para dentro do PBS. Certifique-se de usar um movimento de empurrar, e não de moer.

Como a moagem pode levar à ruptura de células proliferativas maiores, centrifugue as células a no máximo 350 G durante cinco minutos. Em seguida, re-suspenda o pellet em PBS.

Conte as células ressuspensas utilizando um hemocitômetro em um tubo estéril de cinco mililitros de poliestireno. Prepare uma suspensão de um vezes 10 à oitava potência de células por mililitro em PBS com 5% de soro normal de rato. Um máximo de dois mililitros pode ser adicionado a cada tubo.

A seguir, adicione 50 microlitros do coquetel de enriquecimento de linfócitos B negativos EP para cada mililitro de células. Em seguida, tampe os tubos e coloque-os na geladeira por 15 minutos.

Adicione 100 microlitros do coquetel de seleção EP biotinado por cada mililitro de células. Tampe os tubos e coloque-os na geladeira por 15 minutos após a incubação com a mistura de nanopartículas magnéticas EP do coquetel de seleção biotinado e adicione 100 microlitros por cada mililitro de células. Pipete a mistura, tampe os tubos e coloque-os na geladeira por cinco minutos.

Complete a solução até 2,5 mililitros com PBS e coloque em um ímã cept por cinco minutos. Inverta o ímã no tubo e despeje rapidamente em um novo tubo de poliestireno. Não agite o tubo, pois as células negativamente selecionadas estarão ligadas magneticamente às paredes do tubo. Para aumentar ainda mais a pureza da suspensão celular, coloque o novo tubo de células no ímã por cinco minutos, depois despeje novamente em um novo tubo.

Esta etapa pode reduzir a recuperação celular total. A pureza das células B pode ser avaliada por análise citométrica de fluxo de marcadores de superfície de células B. Após o enriquecimento, mais de 95% das células devem ser positivas para B dois 20.

Re-suspenda as células isoladas em PBS aquecido suplementado com BSA a 0,1%, numa concentração final de um milhão de células por mililitro, a partir de uma solução estoque de cinco milimolar do corante CFSE diluído em sulfóxido de dimetila estéril. Adicione dois microlitros para cada mililitro de células no tubo. O CFSE é utilizado para monitorar a divisão celular de células estimuladas.

Um processo essencial para a troca de isotipos. Uma concentração final de 10 micromolar é ideal para a coloração de linfócitos B primários. Incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos no escuro.

Observe que o CFSE é sensível à luz e deve ser mantido ao abrigo da luz sempre que possível. Após a incubação, inative a coloração adicionando um volume igual de soro de bezerro bovino às suas células e incubando no gelo por cinco minutos. Para lavar as células, complete os tubos com meio de cultura, adicionando pelo menos cinco vezes o volume equivalente de meio para contrabalançar a viscosidade do soro de bezerro bovino e permitir que as células formem um pellet; em seguida, centrifugue a 350 × g. Lave as células mais duas vezes com meio de cultura; as células estão agora prontas para estimulação.

Prepare o meio de cultura de linfócitos B in vitro suplementando o RPMI 1640 com 10% de soro bovino fetal e 50 micromolar de etanol beta-metacapta. Em seguida, prepare o meio de estimulação adicionando LPS numa concentração final de 50 microgramas por mililitro. Aliquote 125 microlitros do meio de estimulação em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano com 96 poços.

Prepare as células B coradas com E CFS em meio de cultura sem LPS numa concentração final de 3,2 vezes 10 elevado a seis células por mililitro. Adicione 125 microlitros da suspensão celular aos poços contendo o meio de estimulação e misture pipetando suavemente. Cada poço contém agora 400.000 células numa concentração final de LPS de 25 microgramas por mililitro.

Isso fornece níveis ideais de proliferação celular e troca de classe. Embora alterações nesses valores possam ser feitas conforme desejado, incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 72 a 96 horas. Após 48 horas, aglomerados de grandes células B em proliferação serão claramente visíveis sob microscópio para observar a troca de classe.

Remova as células do incubador e lave-as duas vezes em um mililitro de tampão de marcação para evitar marcação não específica de anticorpos. Pelize as células centrifugando-as a 350 G. Em seguida, reconstitua as células em 100 microlitros de tampão de marcação com 5% de soro normal de camundongo e um micrograma de bloqueador FC por milhão de células e incube por 15 minutos no gelo sem lavar. Adicione um anticorpo secundário anti-IgG de US marcado com fluoróforo a uma concentração de um micrograma por milhão de células, incube por 30 minutos no gelo, lave as células duas vezes e reconstitua-as em dois a 300 microlitros de tampão de marcação.

As células estão agora prontas para avaliação por citometria de fluxo. O CFSE é idealmente excitado a 492 nanômetros por um laser de íon argônio e emite em 517 nanômetros. O espectro de excitação e emissão do anticorpo IgG três depende do corante fluorescente ao qual está conjugado.

Após o enriquecimento magnético, a suspensão celular deve apresentar uma população homogênea de células pequenas e circulares, indistinguíveis entre si. Após 48 a 72 horas de estimulação, aglomerados isolados de células proliferantes aumentadas serão claramente visíveis. Uma grande parte das células não proliferantes parecerá pequena e granular, à medida que sofrerem apoptose.

A RSC normalmente pode ser detectada nos níveis mais altos entre 72 e 96 horas após a estimulação, antes de a maioria das células começar a morrer. Nesta fase, as células já deverão ter passado por várias divisões celulares, com células comutadas surgindo na população mais tardia das células-filhas. Após esses protocolos, outras técnicas, como RNA e silenciamento gênico mediado por IA, podem ser usadas para estudar o efeito de qualquer gene na função de um ID e no processo de recombinação de comutação de classe.