Name: RNAi Triagem para Fatores Hospedeiros Envolvidos na Vaccinia Infecção pelo Vírus usando Drosophila Células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-25T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Aprenda a realizar triagem de RNAi de alto rendimento para identificar fatores hospedeiros envolvidos na infecção viral usando células Drosophila. Este método utiliza microscopia de imunofluorescência para quantificar infecção por vírus vaccinia.

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Este trabalho foi suportado por concessões do NIAID (R01AI074951, U54AI057168) eo Penn Genome Institute Fronteiras para SC, a partir de NIH T32HG000046 a TSM, a partir de NIH T32GM07229 e T32AI007324 de LRS.

Parte 1: RNAi em 384 placas de Bem <ol><li> Padronização dos reagentes utilizados para o rastreio é essencial. Testamos lotes individuais de mídia de Schneider, soro fetal bovino, e reagentes de coloração. Então nós alíquotas e usar o mesmo lote para a tela inteira. </li><li> Para qualquer ensaio, é melhor testar várias linhas de células diferentes para determinar qual é mais receptivo à sua biológico de leitura. Normalmente usamos a linha S2-NUPAD. </li><li> Cultivar células Drosophila a 25 ° C nos meios de comunicação Schneider completo. <ol class="lalpha"><li> Media Schneider </li><li> 10% de calor FBS inativada </li><li> 1X L-glutamina </li><li> 1X Pen / strep antibióticos </li></ol></li><li> Células Drosophila são semi-aderente e são várias passagens sem tripsinização a cada quatro dias por pipetagem as células fora os balões e diluir as células 1:10 em um frasco fresco. As células devem estar em fase de registro para experimentos. </li><li> Placa-to-plate e dia-a-dia variabilidade são minimizados através do uso de manipulação de líquidos automatizado para todas as adições líquidas de multi-lamelas. Nós usamos um WellMate (Matrix). </li><li> Prepare tubulação WellMate. <ol class="lalpha"><li> Spray de capuz e WellMate com etanol 70%. </li><li> Remover tubos de embalagem e de pulverização com etanol 70%. </li><li> Inserir cassete tubulação na dispensação posição no WellMate. </li><li> Tubulação privilegiada, com 25 mL de etanol 70%. </li><li> Esterilizar tubulação em etanol por 15 minutos, então primeiro com outro de 25 mL de etanol. </li><li> Enxágüe tubulação por priming com 50 mL de PBS estéril. </li></ol></li><li> Desalojar células do frasco e contagem. Células pelota para que você tenha 25% a mais do que o necessário (300xg, 5 min). O número de células inoculadas por poço deve ser otimizado de acordo com a duração do ensaio. No âmbito da análise automática de imagem, uma monocamada único sem aglomeração celular é ideal para segmentação de imagem. </li><li> Ressuspender as células peletizada no soro livre de Schneider de mídia em 1.7x10 6 células / mL. </li><li> Realizamos a tela em 384 placas bem pré-aliquotado com uma biblioteca disponível comercialmente de dsRNA em uma concentração de 250ng/well. Vários poços de cada placa são deixados vazios para controles, que são adicionados manualmente. Usamos a luciferase dsRNA como controle negativo. Usamos dsRNA contra Thread (DIAP) como um controle para robusto RNAi. Derrubar resultados deste anti-apoptóticos fator na morte da célula dramática e é uma maneira rápida e visual para avaliar a qualidade do knock down. Por fim, usamos um dsRNA contra o repórter viral, neste caso galacosidase beta, como um controle positivo para validar que pode inibir a infecção viral com o nosso ensaio de leitura. Se detectar dsRNA em placa no momento da semeadura de células, dsRNA alíquota 1 ml para o canto do bem, para facilitar a visualização, em seguida, centrifugar dsRNA em fundo de poço (300xg, 1 min) antes de adicionar células. </li><li> Use WellMate para adicionar 10 mL de células preparadas acima para cada poço. </li><li> Spin-células em placas por centrifugação 300xg, 1 min. </li><li> Incubar 25 ° C em incubadora por 45 minutos. </li><li> Adicionar 20 mL completa Schneider de mídia e centrifugar 300xg, 1 min. </li><li> Placas lugar em recipientes Tupperware umidificado forrado com toalhas de papel embebido em água. O volume de 384 poços é pequena, assim, a evaporação pode ter grandes efeitos sobre a biologia, que por sua vez pode levar a mudanças na artifactual outs leitura dos poços borda. Para superar isso, as placas devem ser mantidos sob alta umidade. </li><li> Incubar durante três dias para permitir a knockdown robusto. Não há necessidade de alterar a mídia ou abrir recipientes umidificado durante este tempo. </li></ol> Parte 2: Infectando com Vaccinia Virus <ol><li> Esterilizar canal multi-aspirador em Quatricide por 15 minutos, em seguida, lavar em etanol 70%. </li><li> Prepare WellMate como descrito acima. </li><li> Prepare media Schneider, com 2% de SFB para a infecção por diluindo completa media 1:05 em soro de mídia livre. </li><li> Estoque de vírus filtro de crude através de seringa 0,8 hum filtro para remover os restos celulares ou uso de vírus purificado. </li><li> Diluir vírus vaccinia em 2% de soro Schneider de mídia para obter multiplicidade de infecção (MOI) de 2. </li><li> Remover PBS a partir de tubos WellMate e privilegiada, com vírus diluído até a tubulação está livre de bolhas de ar. </li><li> Use esterilizados multi-canal de aspiração e coletor de pó para remover suavemente media das placas de células dsRNA tratados com Drosophila. </li><li> Dispense 30 mL por poço de vírus em placas usando o WellMate. </li><li> Centrífuga placas de 1 minuto a 300xg. </li><li> Esterilizar tubulação WellMate. Prime com 25 mL de blea 10%ch, aguarde 10 minutos, e privilegiada, com outra água sanitária de 25 mL de 10%. </li><li> Tubulação Prime com 50 mL de água seguida de 50 mL de etanol a 70%. Retorno tubulação para sua embalagem. </li><li> Retorno placas para recipiente Tupperware umidificado. Incubar a 25 ° C por 48 horas. </li></ol> Parte 3: Placas de coloração <ol><li> Fixar placas em 15 mL de formaldeído 4% / PBS por 10 minutos. Líquido é removido usando um aspirador multi-canal e distribuidor de vácuo em cada etapa. Uma vez que as placas foram fixadas, equipamentos esterilizados e os reagentes não são mais necessárias. </li><li> Remover corrigir e use WellMate para adicionar 30 mL PBST (PBS + 0,1% Triton-X). Incubar 10 minutos e repita. WellMate operar como descrito acima, exceto tubos não precisam ser esterilizados. </li><li> Para detectar a infecção vaccinia usamos um repórter β-galactosidase dirigido por um promotor vaccinia cedo / tarde. </li><li> Remover as células líquido e incubar em bloco (PBST com BSA 2%) por 10 minutos. </li><li> Diluir o anticorpo primário em bloco, remover o líquido e adicionar 15 mL de anticorpos para cada um pipetador de repetição bem usando uma multi-canal (Matrix). </li><li> Spin down placas (300xg, 1 min), cubra com um adesivo claro, e incubar a 4 ° C durante a noite. </li><li> Remover o anticorpo primário, e usar o WellMate para lavar poços em PBST 3 vezes, 10 minutos cada. </li><li> Diluir fluorescente etiquetado anticorpo secundário (FITC) e nuclear mancha em bloco, e adicionar 15 mL de poços usando um multi-canal de pipetador de repetição. </li><li> Incubar as placas de uma hora à temperatura ambiente, protegido da luz. </li><li> Lavar os poços no PBST 3 vezes, 10 minutos cada um usando o WellMate. </li><li> Seal placa com adesivo transparente, capa, e armazenar a 4 ° C até três semanas. </li></ol> Parte 4: Imagem e Análise de Imagem <ol><li> Use um microscópio automatizado com ampliação de 20x para placas de imagem. </li><li> Capturar imagens de núcleos total (DAPI) e as células infectadas (FITC). Otimizar o tempo de exposição para cada canal, individualmente, a fim de maximizar o alcance dinâmico. </li><li> Ajustar a função de foco automático, tendo uma pilha de imagens Z, 1um espaçadas, que abrangem os aviões acima e abaixo do plano previsto de foco. Assim que o avião ideal focal está localizado, ajustar as configurações de focagem automática em conformidade. </li><li> Imagem da placa inteira, captura de pelo menos três imagens por bem, tanto no canal de Hoechst (DAPI) e do canal de vírus (FITC). Escolha sites de várias regiões diferentes dentro de um poço, a fim de capturar imagens que representam o bem como um todo. </li><li> Use MetaXpress software para escrever um diário para o segmento de imagem e usar módulos Núcleos Contar para calcular o número total de células positivas para a coloração nuclear (células total) e infecção (FITC) para cada prato. </li><li> Calcular a infecção por cento (100 células * FITC positivo / total) e log transformar. </li><li> Para identificar os candidatos que usamos uma pontuação Z robusto baseado na mediana e intervalo interquartil de cada prato. Este método é insensível a outliers e dados não simétrica, proporcionando assim maior poder na identificação ainda bate fraca ou moderada 10. Para cada placa, a mediana é subtraído os dados log-transformados. Em seguida, os valores resultantes são divididos por 0,74 vezes o intervalo interquartil (diferença entre os valores do percentil 75 eo percentil 25). O fator 0,74 é utilizado para aproximar uma distribuição normal padrão. </li><li> A pontuação Z robusta é uma medida de distância em desvios-padrão da mediana da placa. Por exemplo, um robusto Z-score de 2 indica a infecção% do poço é de aproximadamente 2 desvios-padrão da mediana placa ou p &lt;0,05. </li><li> Analisar o número de células para identificar candidatos citotóxicos. Calcular o escore Z robusta de contagens nuclear. Candidatos com um robusto Z &lt;-2 em telas duplicadas são considerados citotóxicos. </li><li> Poços que têm uma pontuação Z robusta para a infecção por cento dos&gt; 2 ou &lt;-2 em telas duplicados (p &lt;0,0025), sem citotoxicidade são considerados candidatos potenciais a partir do ecrã principal. </li><li> Candidatos positivos são validados usando reagentes independentes. dsRNAs são gerados contra os genes de interesse de outra região do mRNA e testado como descrito acima. </li><li> Os genes para os quais duas dsRNAs independentes têm o mesmo fenótipo podem ser considerados para um estudo mais aprofundado. </li></ol> Parte 5: Imagens Representante e Interpretação das taxas de infecção <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Poços não infectadas não apresentam qualquer coloração para proteínas do vírus vaccinia, enquanto um representante infectados poço contém células coloração positiva para vaccinia-expressa a proteína beta-galactosidase (βgal), medido por microscopia de imunofluorescência.Virus = verde, núcleos = blue. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Software de análise automatizada de imagem quantifica infecção em cada imagem usando parâmetros definidos pelo usuário. Em uma imagem representativa, o número total de núcleos celulares eo número de células que expressam o antígeno viral são contados com base no tamanho e da intensidade da coloração acima da coloração de fundo local. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Knockdown de thread (DIAP) serve como um controle positivo para o esgotamento RNAi robusto de genes-alvo. Knockdown deste fator anti-apoptótico leva à morte celular dramático. Núcleos = blue. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Knockdown da luciferase serve como um controle negativo para o efeito de double-stranded RNA tratamento sobre a infecção. Esgotamento de luciferase não tem nenhum efeito sobre a infecção em relação às células não tratadas. Virus = verde, núcleos = blue. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Knockdown de proteína βgal serve como um controle positivo para a redução da infecção, já que o ensaio utiliza níveis de proteína βgal como uma leitura de infecção. Esgotamento dos resultados βgal em uma diminuição na porcentagem de células infectadas. Virus = verde, núcleos = blue. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Knockdown de celulares fator Rab5 resulta em uma diminuição da percentagem de células infectadas. Desde Rab5 é conhecido por participar de endocitose, este fator provavelmente contribui para a entrada do vírus vaccinia. Isto representa um outlier exemplo da tela. Virus = verde, núcleos = blue.

<ol><li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).</li>
<li>Chotkowski, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus+infection+of+Drosophila+melanogaster+induces+a+protective+RNAi+response%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response.</a> Virology. 377, 197-206 (2008).</li>
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<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+RNAi+screening+in+Drosophila+S2+cells%3A+what+have+we+learned+about+host-pathogen+interactions%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions?</a> Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).</li>
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<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+activity+coupled+with+fatty+acid+biosynthesis+is+required+for+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication.</a> PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+specific+sensitivity+of+IRES-containing+RNA+viruses+to+host+translation+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition.</a> Genes Dev. 19, 445-452 (2005).</li>
<li>Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Kinome+RNAi+Screen+Identified+AMPK+as+Promoting+Poxvirus+Entry+through+the+Control+of+Actin+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics.</a> PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Genoma de despistagem RNAi em Drosophila fornece um método robusto e eficiente para a análise da componente celular da infecção viral. Um número de vírus infectam as células de mamíferos Drosophila, que pode ser usado para identificar os componentes da máquina de resposta intrínseca imunológico e fatores do hospedeiro proteínas necessárias para a replicação viral que pode representar novos alvos terapêuticos. Antes de executar uma tela, o ensaio deve ser cuidadosamente otimizado para o tipo de célula, número de células, e nível de infecção, e deve ser bem controlada, incluindo tanto positivas como negativas viral e alvos celulares 11. É importante garantir a separação suficiente entre os controles positivos e negativos antes de triagem para maximizar a gama dinâmica do ensaio. Uma vez que a tela foi realizada, os candidatos podem ser divididos em categorias funcionais para determinar quais os mecanismos de acolhimento contribuem para a infecção. Em busca de vírus vaccinia mamíferos, tais como, a contribuição dos homólogos mamíferos por RNAi deve ser determinada como parte da análise secundária. Juntos, esses métodos de triagem robusta nos permitirá ganhar a introspecção em mecanismos complexos pelos quais os vírus interagem com as células do hospedeiro.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cultura celular&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio Schneider&amp;rsquo;s</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11720</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 100X</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina (pen/estrept)</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Triagem&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biblioteca de dsRNA em genoma inteiro</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de 384 poços, pretas com fundo transparente</td><td>Corning</td><td>3712</td><td></td></tr><tr><td>Tampas de alumínio</td><td>Corning</td><td>6569</td><td></td></tr><tr><td>Tampas transparentes</td><td>Denville Scientific</td><td>B1212-4</td><td></td></tr><tr><td>Well Mate</td><td>Matlab</td><td>201-10001</td><td></td></tr><tr><td>Bancada de 24 pinos</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-101</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos secundários marcados com fluoróforo</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsscópio automatizado ImageXpressMicro</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de análise de imagens MetaXpress</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rnai triagem para fatores hospedeiros envolvidos na vaccinia infecção pelo vírus usando drosophila células

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Patógenos virais representam uma ameaça de saúde pública, não só pode causar epidemias vírus natural da doença humana, mas o seu uso potencial em bioterrorismo também é uma preocupação. Uma melhor compreensão dos fatores celulares que a infecção impacto seria facilitar o desenvolvimento de muito necessária terapêutica. Os recentes avanços na tecnologia de interferência de RNA (RNAi) juntamente com o seqüenciamento do genoma completo de vários organismos levou para a otimização do genome-wide, baseada em células de perda de função-telas. Células Drosophila são particularmente passíveis de genoma escala de telas por causa da facilidade e eficiência de RNAi neste sistema 1. Importante, uma grande variedade de vírus podem infectar as células Drosophila, incluindo um número de vírus de mamíferos de importância médica e agrícola 2,3,4. Telas anteriores RNAi em Drosophila identificou factores do hospedeiro que são necessários para as várias etapas na infecção pelo vírus, incluindo entrada, tradução e replicação de RNA 5. Além disso, muitos dos fatores celulares necessárias para a replicação viral em cultura de células Drosophila também são limitantes nas células humanas infectadas com estes vírus 4,6,7,8, 9. Portanto, a identificação de fatores do hospedeiro cooptados durante a infecção viral apresenta novos alvos para a terapêutica antiviral. Aqui apresentamos um protocolo generalizada para uma tela de RNAi de alto rendimento para identificar os fatores celulares envolvidos na infecção viral, usando vírus vaccinia como um exemplo.

Novos fatores hospedeiro envolvidos na infecção viral podem ser identificados através de células baseado em perda de todo o genoma da função de triagem RNAi. A<em&gt; Drosophila</em&gt; Modelo de cultura de células é particularmente receptivo a esta abordagem, devido à facilidade e eficiência de RNAi. Aqui demonstramos esta técnica usando<em&gt; Vaccinia</em&gt; Vírus como um exemplo.

RNAi Triagem para Fatores Hospedeiros Envolvidos na Vaccinia Infecção pelo Vírus usando Drosophila Células

Patógenos virais representam uma ameaça significativa à saúde pública; os vírus não apenas podem causar epidemias naturais de doenças humanas, mas o seu uso potencial em ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar triagem de RNAi de alto rendimento para identificar fatores do hospedeiro envolvidos na infecção viral. Isso é realizado primeiramente pela diminuição dos genes de interesse por RNAi em placas de 384 poços. Em seguida, as células são desafiadas com o vírus de interesse, coradas para proteínas virais e analisadas quanto à infecção viral por microscopia de imunofluorescência.Por fim, é realizada uma análise automatizada de imagens para identificar genes candidatos à validação e a estudos posteriores. Em última instância, podem ser obtidos resultados que demonstram alterações na infecção por meio da quantificação da porcentagem de células infectadas utilizando microscopia de imunofluorescência. Isso permite a descoberta de novos fatores celulares envolvidos na infecção viral.Embora este método possa fornecer informações sobre as interações entre vírus e hospedeiro, ele também pode ser aplicado ao estudo de qualquer sistema que se beneficie do uso de uma leitura visual do processo celular de interesse. Indivíduos novos neste método devem esperar uma curva de aprendizado acentuada, pois obter infecções reprodutíveis enquanto se minimiza a variabilidade exige uma otimização considerável. Para garantir a reprodutibilidade dos resultados, é essencial utilizar um único número de lote para cada reagente usado em toda a triagem. Cultive células de drosófila S2DRSC em meio Schneider completo a 25 graus Celsius; as células devem estar em fase logarítmica.Para experimentos em câmara de fluxo laminar, desprenda as células semiadherentes do frasco por pipetagem vigorosa. Conte em um hemocitômetro, transfira 125% das células necessárias para o experimento para um tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue a 300 ×g durante cinco minutos. Aspire o sobrenadante e reconstitua o pellet em uma concentração final de 1,7 × 10⁶ células por mililitro em meio Schneider sem soro.Utilize um sistema automatizado de manipulação líquida esterilizado e preparado. Aqui, o poço da matriz é pareado para minimizar a variabilidade entre as placas. Adicione 10 microlitros de suspensão celular a cada poço de uma placa de 384 poços previamente revestida com 250 nanogramas por poço de RNA de fita dupla. Centrifugue as células nas placas a 300 ×g por um minuto.Incube as placas a 25 graus Celsius por 45 minutos. Adicione 20 microlitros de meio completo de Schneider a cada poço. Centrifugue brevemente o meio a 300 ×g por um minuto para minimizar os efeitos da evaporação.Armazene as placas em recipientes selados e umidificados, forrados com toalhas de papel embebidas em água. Incube a 25 graus Celsius por três dias para permitir efeitos robustos de silenciamento em uma cabine de biossegurança nível dois. Antes de infectar as células, filtre o estoque bruto do vírus vaccínia através de um filtro de seringa de 0,8 mícron.Para remover detritos celulares. Dilua o vírus em meio Schneider com 2% de soro para obter uma multiplicidade de infecção. Abreviada MOI de dois prime.O poço esterilizado é preenchido com o vírus diluído até que o tubo fique livre de bolhas de ar. Utilizando um aspirador multicanal esterilizado com manifold a vácuo, remova suavemente o meio das placas de células de drosófila tratadas com RNA de fita dupla. Adicione 30 microlitros do vírus diluído em cada placa.Centrifugue bem as placas a 300 G durante um minuto. Retorne as placas ao recipiente umidificado e incube a 25 graus Celsius por 48 horas. Em uma cabine de biossegurança nível BSL dois, aspire o meio da placa.Em seguida, utilize uma pipeta multicanal para adicionar 15 microlitros de fixador de formaldeído 4% a cada poço. Incube em temperatura ambiente por 15 minutos. Remova o líquido com um aspirador multicanal.Use o WELLMADE para adicionar 30 microlitros de PBST a cada poço. Incube os poços à temperatura ambiente por 10 minutos. Realize uma segunda lavagem com PBST de 10 minutos da mesma maneira.Remova o líquido após o bloco de incubação e adicione 30 microlitros de solução bloqueadora PBST com 2% VSA. Incube à temperatura ambiente por 10 minutos. Utilize uma pipeta multicanal repetidora para adicionar 15 microlitros de anticorpo primário diluído na solução bloqueadora a cada poço.Centrifugue bem as placas a 300 G durante um minuto. Sobreponha cada placa com filme adesivo transparente e incube a quatro graus Celsius durante a noite. Utilize o selador de placas e o aspirador multicanal para lavar as células em PBST três vezes, com cada lavagem durando 10 minutos.Use um pipetador multicanal para adicionar 15 microlitros de anticorpo secundário marcado com fluoróforo e corante nuclear a cada poço. Cubra com papel alumínio para proteger da luz e incube as placas à temperatura ambiente por uma hora. Lave as células com PBST três vezes, como antes, por 10 minutos cada lavagem.Adicione 30 microlitros de PBST às células e feche com uma película transparente. Cubra com papel alumínio e armazene as placas fechadas a quatro graus Celsius por até três semanas antes da imagem em um microscópio automatizado.Poços não infectados não apresentam qualquer coloração para proteínas do vírus vaccinia, enquanto um poço infectado representativo contém células. Coloração positiva para a proteína beta GCSEs expressa pelo vaccinia, conforme medido por microscopia de imunofluorescência. Um software de análise automatizada de imagens quantifica a infecção em cada imagem utilizando parâmetros definidos pelo usuário.Em uma imagem representativa, o número total de núcleos celulares e o número de células que expressam antígeno viral são contados com base no tamanho e na intensidade da coloração acima do fundo local. O silenciamento da expressão de thread serve como controle positivo para a redução eficaz de genes-alvo por RNAi. O silenciamento desse fator antiapoptótico leva à morte celular drástica.O silenciamento da luciferase serve como controle negativo para o efeito do RNA de dupla fita no tratamento da infecção. A depleção da luciferase não tem efeito sobre a infecção em comparação com células não tratadas. O silenciamento da proteína beta-galactosídase serve como controle positivo para uma redução na infecção.Como o ensaio utiliza os níveis da proteína beta galacto como indicador de infecção, o esgotamento da beta galacto resulta em uma diminuição na porcentagem de células infectadas. A redução do fator celular RAB cinco resulta em uma diminuição na porcentagem de células infectadas. Como se sabe que RAB cinco participa da endocitose, esse fator provavelmente contribui para a entrada do vírus vaccinia.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar a triagem por RNAi em drosófila para identificar fatores do hospedeiro que contribuem para a infecção viral, incluindo a realização de RNAi, infecção com o vírus vaccinia, coloração, obtenção de imagens e análise de placas de 384 poços. Não se esqueça de que trabalhar com o vírus DIA pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de jalecos laboratoriais e óculos de proteção, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento. O vírus vivo só deve ser manipulado dentro de uma cabine de biossegurança nível BSL-2, e qualquer material em contato com o vírus vivo deve ser esterilizado em água sanitária a 10% antes da eliminação.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Interferência de RNA tem se mostrado muito eficaz para analisar a função do gene...

RNAi Interferência por injeção dsRNA em Drosophila Os embriões

Nós descrevemos um método sensibilizada para identificar os reguladores pós-embrionário de expressão da proteína e localização...

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para realizar uma nanoinjeção de um vírus de RNA de fita simples de sentido positivo em moscas Drosophila machos adultos e, posteriormente, estudamos as respostas antivirais iniciadas devido à infecção. A análise da reação em cadeia da polimerase identifica a regulação positiva de genes específicos nas moscas infectadas que indicam a ativação das vias de resposta imune, incluindo interferência de RNA e sinalização JAK / STAT.

Nanoinjeção viral intratorácica para estudar interações vírus-hospedeiro em moscas adultas

O objetivo desta publicação é visualizar e discutir os passos operatórios de um protocolo de Northern Blot em RNA extraído de Drosophila melanogaster avançado embriões, células e tecidos. Este protocolo é particularmente útil para a detecção eficiente de espécies de ARN pequenas.

Aprimorada do Norte Detecção Blot de pequeno RNA de espécies em Drosophila melanogaster

Aqui descrevemos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para descobrir destinos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos, especificamente a terapia rhabodvirus e vaccinia vírus, mas pode ser facilmente adaptado para outros Oncolíticos plataformas de vírus ou para descobrir genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus em geral.

Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia

Este método demonstra como visualizar a invasão do patógeno em células de inseto com modelos tridimensionais (3D). Hemócitos de larvas de Drosophila foram infectados com patógenos virais ou bacterianos, ou ex vivo ou no vivo. Hemócitos infectados foram, em seguida, fixa e manchados para a imagem latente com um microscópio confocal e subsequente reconstrução celular 3D.

Extração de hemócitos de larvas de Drosophila melanogaster para infecção microbiana e análise

Aqui, apresentamos os protocolos para identificar imunomoduladores 1) vírus-codificado que promovem a replicação de arbovírus e fatores do hospedeiro 2) eucariota que restringem a replicação de arbovírus. Esses métodos baseados em fluorescência e luminescência permitem aos investigadores para rapidamente obter leituras quantitativas de replicação de arbovírus em simplistas ensaios com baixa relação sinal-ruído.

Arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores Antiviral Viral de imunomoduladores e Host

Este protocolo descreve uma metodologia de microinjeção que temos padronizado e utilizado por vários anos para entregar quantidades específicas de ácidos nucleicos diretamente a hemolinfa de mosquitos e moscas domésticas. Este protocolo resulta em mortalidade de injeção mínima e permite medições de dose correlacionado de fecundidade.

Reprodutível dsRNA Microinjection e Bioassay de oviposição em mosquitos e moscas domésticas

Este protocolo descreve como estabelecer infecção viral na vivo em Drosophila melanogaster , usando o método de nano-injeção e técnicas básicas para analisar a interação vírus-hospedeiro.

Estabelecimento de infecção Viral e análise da interação vírus-hospedeiro em Drosophila Melanogaster.

Este protocolo descreve um ensaio in vivo de fagocitose no adulto Drosophila melanogaster para quantificar o fagócito reconhecimento e apuramento das infecções microbianas.

Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo

Nós apresentamos um protocolo usando uma aproximação genética para a frente à tela para os mutantes que exibem a neurodegeneração no melanogaster de Drosophila. Incorpora um ensaio de escalada, uma análise da histologia, um mapeamento do gene e um sequenciamento do ADN para identificar finalmente genes novos relativos ao processo de neuroprotection.

In vivo Forward genética Screen para identificar novos genes neuroprotetores em Drosophila melanogaster

Aprenda a realizar triagem de RNAi de alto rendimento para identificar fatores hospedeiros envolvidos na infecção viral usando células Drosophila. Este método utiliza microscopia de imunofluorescência para quantificar infecção por vírus vaccinia.

RNAi Triagem para Fatores Hospedeiros Envolvidos na Vaccinia Infecção pelo Vírus usando Drosophila Células

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