Northern blot para detectar e quantificar microRNA específico no extrato total de RNA do tecido vegetal

MicroRNAs, miRNAs, são RNAs pequenos, de fita simples e não codificantes. Os miRNAs se incorporam a um complexo multiproteico e se ligam a sequências de mRNA alvo complementares para regular negativamente a expressão gênica.

Para detectar miRNA específico do RNA total dos tecidos vegetais, adicione um corante de carregamento de gel contendo corantes de rastreamento e formamida - um agente desnaturante de RNA. Aqueça a amostra para desnaturar o RNA e evitar a formação de estrutura secundária antes da eletroforese.

Carregue a amostra e os marcadores de RNA padrão em poços de um gel de poliacrilamida desnaturante pré-montado. Execute a eletroforese, facilitando a separação baseada no tamanho dos fragmentos de RNA.

Transfira o gel para papéis de filtro pré-úmidos em um de eletroborrão. Alinhe uma membrana de nylon embebida em tampão sobre o gel. Em seguida, empilhe os papéis de filtro pré-úmidos. Realize eletroblotting.

A corrente elétrica faz com que o RNA carregado negativamente, incluindo o miRNA, saia do gel para a superfície da membrana de náilon carregada positivamente. Exponha a membrana à luz ultravioleta; isso reticula os RNAs à membrana, evitando assim a perda de RNA.

Incube a membrana em tampão de hibridização contendo agentes bloqueadores que ocupam os locais de ligação não específicos para reduzir o ruído de fundo.

Adicione uma sonda de oligonucleotídeo de RNA radiomarcada complementar ao miRNA alvo para se ligar especificamente a ele. Lave a membrana com tampão, removendo as sondas não ligadas.

Use um sistema de imagem de fósforo para detectar e quantificar as intensidades do sinal de hibridização radioativa. O sinal de alta resolução indica a expressão específica de miRNA no tecido vegetal.