Name: O isolamento de lipoproteínas de alta densidade para não codificante pequeno ARN Quantificação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprenda a isolar lipoproteínas de alta densidade e quantificar pequenos RNAs não codificantes usando ultracentrifugação em gradiente de densidade. Este método avança o potencial dessas moléculas como biomarcadores em doenças cardiometabólicas.

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Este trabalho foi apoiado por prêmios do National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute para K.C.V. HL128996, HL113039 e HL116263. Este trabalho também foi apoiado por prêmios da American Heart Association para K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 e R.M.A. POST25710170.

1. A purificação de HDL (~ 5,5 dias) <ol><li> Gradiente de densidade de Ultracentrifugação (DGUC, ~ 5 dias) <ol><li> Adicionar 90 uL de 100x anti-oxidantes para 9 ml de plasma isolados a partir de sangue venoso fresco. </li><li> Ajustar a densidade de plasma com KBr partir de 1,006 g / mL a 1,025 g / mL por adição de 0,251 g de KBr a 9 mL de plasma a partir do passo 1.1.1 (0,0278 g / ml de plasma de KBr). Balance o plasma até que todo o sal é dissolvido à temperatura ambiente e transferir para tubos de ultracentrífuga e assegurar que todas as bolhas subam para o topo. </li><li> Dobre a ponta de uma agulha de 18 G a 90 ° 1 cm da ponta, o lado bisel voltado para cima. Usando uma seringa e a agulha de calibre 18, coloque cuidadosamente 3 mL de solução de sobreposição # 1 sobre o plasma (Tabela 1). NOTA: A agulha torta garante todo o VLDL / IDL, LDL e HDL são removidos sem se misturar com a sobreposição. </li><li> Remover a maior parte das bolhas na parte superior, deixando 2 - espaço de 3 mm da menisco para a parte superior do tubo e carefully colocar os tubos em baldes SW-40Ti. </li><li> Pesar cada balde (com as tampas) sobre o saldo, e exatamente equilibrar com o balde oposto (balde + cap): # 1 a # 4, # 2 e # 5 e # 3 a # 6. NOTA: Estes baldes deve ser equilibrado e combinados em todos os momentos. </li><li> Coloque rotor em ultracentrífuga (Lista de Materiais). Centrifugar a 274.400 xg durante 24 h a 4 ° C com um freio intermédia # 4. </li><li> Remova cuidadosamente baldes de rotor e os tubos de baldes. </li><li> remover cuidadosamente 2 mL da camada de topo da sobreposição usando uma seringa e uma agulha dobrada. Esta será a fracção VLDL / IDL que pode ser armazenado a 4 ° C ou -80 ° C. </li><li> Após a remoção da fração VLDL / IDL, recolher os restantes 7 mL de amostra (plasma) e colocá-lo em um tubo cônico de 15 mL. Perfazer o volume da amostra até a 9 ml com solução de sobreposição # 2 (Tabela 1). </li><li> Ajustar a densidade da amostra de 1,025 g / mL a 1,080 g / ml com KBr usandocerca de 0,746 g de KBr na amostra 9 mL ou 0,0828 g / mL KBr da amostra. Agite suavemente a amostra até que todo o KBr é dissolvido (aproximadamente 20 min) e transferir para ultracentrífuga tubo, enquanto bolhas garantindo subir ao topo. </li><li> Com seringa e agulha, coloque cuidadosamente 3 mL de solução de sobreposição # 3 sobre a amostra (Tabela 1). Deixar 2-3 mm de espaço menisco para o topo do tubo. </li><li> Remover a maior parte de todas as bolhas restantes na parte superior do tubo e colocar os tubos de ultracentrífuga cuidadosamente cheios em baldes SW-40Ti. </li><li> Pesar cada balde (com as tampas) sobre o saldo, e exatamente equilibrar com o balde oposto + cap, como em 1.1.5. </li><li> Coloque rotor em ultracentrífuga (veja Lista de Materiais). Centrifugar a 274.400 xg durante 24 h a 4 ° C com um freio intermédia # 4. </li><li> Remova cuidadosamente baldes de rotor e os tubos de baldes. </li><li> remover cuidadosamente 2 mL da camada de topo da sobreposição usando uma seringa e seragulha nt. Esta será a fracção de LDL, que pode ser armazenado a 4 ° C ou -80 ° C. </li><li> Após a remoção da fração LDL, recolher os restantes aproximados 7 ml de amostra (plasma) e colocá-lo em um novo tubo cônico de 15 mL. Perfazer o volume da amostra (plasma) até 9 mL com 1,080 g / mL de solução de # 4 (Tabela 1). </li><li> Ajustar a densidade da amostra de 1,080 g / mL a 1,30 g / ml com KBr utilizando 3,33 g de KBr em 9 mL de amostra (plasma) ou 0,37 g de KBr para cada mL de amostra. Rocha ou ligeiramente agitar a amostra até que todo o KBr (sal) é dissolvida e transferir para ultracentrífuga tubo. </li><li> Com seringa e agulha, coloque cuidadosamente 3 mL de solução de sobreposição # 5 sobre a amostra (Tabela 1). </li><li> Remover a maior parte de todas as bolhas restantes na parte superior do tubo, deixando o ácido 2- espaço de 3 mm da menisco para a parte superior do tubo e colocar os tubos de ultracentrífuga cuidadosamente cheios em baldes SW-40Ti. </li><li> Pesar cada balde (com as tampas) sobre o equilíbrio, e exatamente equilibrar com o balde oposto + cap, como em 1.1.5. </li><li> Coloque rotor em ultracentrífuga (veja Lista de Materiais). Centrifugar a 274.400 xg durante 48 h a 4 ° C com um freio # 4. </li><li> Remova cuidadosamente baldes de rotor e os tubos de baldes. </li><li> Cuidadosamente remover cerca de 2 ml a partir da camada de topo da sobreposição usando uma seringa e uma agulha dobrada. Esta é a fracção HDL, o qual pode ser armazenado a 4 ° C ou -80 ° C. NOTA: Seguindo DGUC HDL pode ser dialisada para remover as soluções de alto teor salino. </li><li> Para diálise, coloque a fração HDL recolhida em uma manga de diálise selado (10.000 MW de corte) e diálise durante a noite em 1 L 1x PBS. tampão mudança de diálise (1x PBS) 3 vezes ao longo de 24 h. perturbação suave do PBS com um agitar-barra magnética irá melhorar diálise. </li><li> Determinar a concentração de proteína do DGUC-HDL usando um método BCA 8. </li></ol></li><li> Fast-Protein líquido Chrocromatografia em fase (FPLC) ou cromatografia de exclusão de tamanho (~ 6 h) <ol><li> Filtro de 1,2 mg de DGUC-HDL (proteína total) em 500 mL através de um filtro de 0,22 um micro-centrífuga (ver Lista de Materiais), imediatamente antes da injecção. NOTA: Uma filtragem adicional da amostra DGUC-HDL através de um filtro de 0,45 um micro-centrífuga antes do filtro de 0,22? M podem ser necessários para algumas amostras. </li><li> Coletar a amostra DGUC-HDL filtrada, carregar a seringa de injeção FPLC (preenchimento), e garantir que não haja bolhas na seringa antes de injetar na FPLC. </li><li> Definir a taxa de fluxo de FPLC de 0,3 mL / min com um limite de pressão de 2,6 MPa. Equilibrar as colunas com 0,2 volumes de coluna (aproximadamente 15 ml) de tampão, antes da amostra de injecção. Injectar a amostra com 3 ml de tampão para o (septo de injecção) instrumento FPLC e iniciar a execução. Recolha fracções de 1,5 mL para um total de 72 fracções. </li></ol></li></ol> 2. alta taxa de transferência RNA pequenoSequenciamento (sRNAseq, ~ 9 dias) <ol><li> Isolamento de ARN (~ 1 dia) <ol><li> Identificar as correspondentes fracções de FPLC de DGUC-HDL por meio da determinação dos níveis de colesterol total utilizando um kit colorimétrico de acordo com as instruções do fabricante. Usando este FPLC set-up, espera encontrar 6 - 7 fracções de FPLC contendo DGUC-HDL. </li><li> Recolher todo o volume (cerca de 8 -1 0 mL piscina de 1,45 fração mL volumes) a partir de fracções DGUC-HDL FPLC e concentrar usando 10 kDa mw unidades de filtragem centrífuga de corte a 4.000 xg durante 1 h a 4 ° C ou até concentrado HDL é de aproximadamente 100 mL. </li><li> Recolhe-se o concentrado de HDL e quantificar a concentração de proteína total de HDL utilizando o método BCA 8. </li><li> Determinar a concentração mais alta de proteína total de HDL, até 1 mg, que pode ser dividido em alíquotas de cada amostra no conjunto. Por exemplo, isolar o ARN a partir da mesma quantidade de proteína total de HDL para cada amostra. </li><li> Isolamento de ARN utilizando executarum protocolo modificado (veja Lista de Materiais). <ol><li> Adicionar 10 x o volume de reagente fenol lise (veja Lista de Materiais) da amostra e vortex por 1 min. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Adicionar clorofórmio (20% de volume de reagente de lise de fenol utilizado no passo 2.1.5.1) e agitar vigorosamente durante 15 segundos. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 2-3 minutos. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 12000 xg, a 4 ° C numa centrífuga refrigerada. </li><li> Transferir a fase aquosa superior para um novo tubo, evitando a interfase. </li><li> Adicionar volume de 1,5 x de 100% de etanol à fase aquosa e agitar com vortex durante 1 min. </li><li> Armazenar as amostras de, pelo menos, 1 hora ou durante a noite a -80 ° C. </li><li> Continue com o protocolo de isolamento do RNA usando o mini-colunas fornecidas. </li><li> Eluir com 30 H mL de RNase 2 O. Em primeiro lugar, adicionar 15 mL de H2O directamente para a frita, centrifugação a baixa velocidade (2000 xg) durante 2 min, eem seguida girar a alta velocidade (max) durante 1 min. Repetir esta etapa com um adicional de 15 mL de H 2 O. </li></ol></li><li> proceder imediatamente a sRNA geração ou armazenamento de biblioteca a -80 ° C. </li></ol></li><li> Geração de biblioteca (~ 6 h) <ol><li> Preparar bibliotecas de ADNc sRNA usando o protocolo do kit sRNA biblioteca geração, conforme as instruções do fabricante, com uma modificação para a amplificação por PCR, conforme detalhado abaixo. <ol><li> Prepara-se o mastermix PCR em gelo, contendo 0,5 mL de DNase / RNase H 2 O, 15 ul mistura de PCR (LMP) e 1 uL Iniciador de PCR de ARN (RP1) por amostra (incluem um 10% adicional para a pipetagem de erro). </li><li> Adicionar 16.5 ul de mistura de PCR a cada amostra (ADNc). </li><li> Atribuir um número de índice / de código de barras de cada amostra para a multiplexação e adicionar 1 mL Índice de iniciador de PCR (com o número correspondente) à amostra. </li><li> Executar uma rotação rápida usando o microcentrífuga. NOTA: O volume total deveagora ser de 30 mL por amostra. </li><li> Efectuar as condições de ciclização para a amplificação por PCR como descrito nos quadros 2 e 3. </li></ol></li></ol></li><li> Tamanho Selecione sRNA Biblioteca remover do adaptador: Adaptadores (~ 1,5 h) <ol><li> Executar biblioteca de tamanho seleção usando seletor do tamanho do DNA automática de acordo com as instruções do fabricante com os parâmetros de tamanho seguintes: Alvo: 156 pb, de início: 135 pb, End: 177 pb, Bandeira Range: Broad. </li></ol></li><li> DNA Clean Up (~ 0,5 h) <ol><li> Limpar tamanho seleccionado de cDNA sRNA de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Eluir limpo e concentrada cDNA sRNA com 2 x 7 mL DNase / RNase H 2 O. </li></ol></li><li> Quantificar e avaliar sRNA cDNA Biblioteca Rendimento e Qualidade (~ 1 h) <ol><li> Avaliar a qualidade biblioteca de cDNA sRNA e tamanho usando um chip de DNA de alta sensibilidade em um Bioanalyzer (Lista de Materiais) como por manufactinstruções do Urer. </li><li> Quantificar as concentrações individuais biblioteca de ADNc sRNA utilizando um ensaio de ADN de alta sensibilidade (Lista de Materiais), de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: Recomenda-se a ter todas as amostras com índices diferentes ser executados na mesma pista da célula de fluxo, se possível. Se mais do que uma pista é necessário, misturar amostras de casos e de controlo de forma adequada. </li></ol></li><li> De alto rendimento sRNA Sequencing (~ 7 dias) <ol><li> Piscina indivíduo indexados bibliotecas Srna baseado em concentrações equimolares. </li><li> Tela reunidas bibliotecas Srna para a qualidade usando chip de DNA de alta sensibilidade no Bioanalyzer e determinar a concentração de DNA biblioteca como em 2.5.1 - 2.5.2. </li><li> Executar PCR quantitativo (qPCR) do conteúdo adaptador para garantir profundidade sequência apropriada usando a biblioteca de sequenciamento kit qPCR quantificação de acordo com as instruções do fabricante (Lista de Materiais). </li><li> Execute sequenciamento usando uma única leitura, 50 bp protocolo para atingir uma profundidade de cerca de 20 - 25 M leituras / amostra, de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol></li></ol> 3. Análise de Dados (~ 1 dia) <ol><li> Use bcl2fastq2, conforme instruções guia do usuário, para arquivos raw fastq preprocess de amostras desmultiplexados (Lista de Materiais). </li><li> Use Cutadapt para cortar placas de 9 e remover lê &lt;16 nucleótidos (nts) de comprimento, conforme instruções guia do usuário (Lista de Materiais). </li><li> Remover as sequências de contaminação presente nas bibliotecas Srna, incluindo sequência de solução de paragem (STP: CCACGTTCCCGTGG) e adaptador de carry-over (CTACAGTCCGACGATC) utilizando a função removeSequenceInFastq no quadro NGSPERL, conforme instruções guia do usuário (Lista de Materiais). </li><li> Execute métricas de controle de qualidade por FastQC usando Centro de Ciências quantitativas (CQS) ferramentas, como por instruções guia do usuário (Lista de Materiais). </li><li> Gerar lista não redundante de &quot;idêntico&quot; lê (redunda colapsont lê) e números de cópias registro usando CQSTools, conforme instruções guia do usuário (Lista de Materiais). </li><li> Alinhar lê a genoma humano usando Bowtie1.1.2 permitindo que 1 corresponde (opções: -a -m 100 --best --strata -v 1), conforme instruções guia do usuário (Lista de Materiais). </li><li> Execute ler alinhamento, contagem e resultar tarefas de compactação usando NGSPERL, conforme instruções Guia do Usuário. </li><li> Converter tabela de contagem exportado para um arquivo de planilha. </li><li> Normalize lê de uma classe específica (por exemplo, miRNAs) ao número total de leituras para essa classe (por exemplo, o número total de miRNAs lê) e sinais de relatório como Lê miRNA Per mapeada (RPMM). (Por exemplo, RPMM = (miR-X / Número total de miRNA lê) * 1.000.000). </li><li> Entrada normalizada tabela de contagem de como a tecnologia única cor genérico para software de baixo nível e diferencial de alto nível analisa como por instruções guia do usuário (Lista de Materiais). NOTA: Atualmente, existem genes de limpeza não bem caracterizados / SRNComo para o HDL-sRNA. Um controlo de pico-em podem ser usados, mas pode ser problemático. Normalizando para HDL entrada de proteína total ou volume é aconselhada. Mais importante ainda, é recomendado para validar os resultados de sequenciação de uma das várias estratégias para quantificar miARNs e sRNAs utilizando PCR em tempo real ou PCR quantitativo. </li></ol>

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<li>Cheung, M. C., Wolf, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+ultracentrifugation+on+apolipoprotein+A-I-containing+lipoprotein+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations.</a> J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).</li>
<li>Kunitake, S. T., Kane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+integrity+of+high+density+lipoproteins+in+the+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge.</a> J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> J Extracell Vesicles. 4, 26533(2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo é concebido para quantificar miARNs e outros sRNAs por sequenciação de alto rendimento ou PCR em tempo real sobre o HDL altamente pura. Tal como acontece com qualquer abordagem, considerações especiais deve ser dada para cada passo no processo de purificação de HDL e de ARN e, em seguida quantificando sRNAs. Este protocolo é projetado para projetos começando com ≥ 2 mL de plasma. No entanto, análises de ARN de elevada qualidade pode com sucesso ser completado com HDL purificada a partir de tão pouco quant...

Não codificantes pequenos RNAs extracelular (sRNAs) representam uma nova classe de marcadores de doença e potenciais alvos terapêuticos e provavelmente facilitar a comunicação uma célula-a-célula. O tipo mais amplamente estudado de sRNA são microRNAs (miRNA), que são cerca de 22 nts de comprimento e são processados de formas precursoras mais longos e transcritos primários 2. miARNs foram demonstradas para o pós-transcricionalmente regular a expressão do gene através da supressão da tradução de proteínas e a indução do ARNm da degradação 2. No entanto, os miRNAs são apenas um dos muitos tipos de sRNAs; como sRNAs pode ser clivada a partir tRNAs mãe (sRNAs derivados de tRNA, o TDR), RNAs pequenos nucleares (sRNAs sRNA derivados, sndRNA), pequenos RNAs nucleolares (sRNAs snoRNA derivados, snRNA), RNAs ribossomais (sRNAs, RDR rRNA derivado ), Y (RNAs yDR), e outros RNAs 1 variado. Alguns exemplos destes novos sRNAs têm sido relatados para funcionar semelhante ao miARNs; No entanto, o fu biológicanctions de muitos destes sRNAs permanece a ser determinada, embora papéis na regulação do gene são provavelmente 3-6. Mais interessante, miARNs e outros sRNAs são estavelmente presente nos fluidos extracelulares, incluindo a saliva, plasma, urina, e biliar. sRNAs extracelular são provavelmente protegido contra RNases através da sua associação com vesículas extracelulares (EV), lipoproteínas, e / ou complexos de ribonucleoproteína extracelulares. Anteriormente, relatou que as lipoproteínas, ou seja, lipoproteínas de alta densidade (HDL), miRNAs de transporte no plasma 7. Neste estudo, o HDL foram isoladas utilizando um método sequencial de ultracentrifugação em gradiente de densidade (DGUC), cromatografia líquida rápida de proteínas (filtração em gel A cromatografia de exclusão de tamanho, FPLC), e imunoprecipitação de cromatografia de afinidade (anti-apolipoproteína AI (apo AI) ) 7. Utilizando ambas as matrizes de baixa densidade baseada em PCR em tempo real e ensaios de miARN individuais, níveis de miARN foram quantificados em HDL isolada a partir de curarthy e indivíduos com hipercolesterolemia 7. Usando essa abordagem, fomos capazes de perfil miRNAs e quantificar miRNAs específicos em preparações de HDL altamente puros. Desde 2011, nós determinamos que, apesar de cromatografia de afinidade melhora a pureza HDL, saturação de anticorpo limita grandemente o rendimento, e pode ser um custo proibitivo. Actualmente, o protocolo recomenda um método conjunto sequencial de dois passos de DGUC seguido por FPLC, que também produz amostras de HDL elevado de qualidade para a jusante de isolamento de ARN e sRNA quantificação. Devido aos recentes avanços no sequenciamento de alto rendimento de sRNAs (sRNAseq), por exemplo, os miRNAs, eo aumento da consciência de outras classes não-miRNA Srna, sRNAseq é o atual estado-da-arte em miRNA e sRNA profiling. Como tal, o nosso protocolo recomenda quantificar miRNAs e outros sRNAs em amostras de HDL usando sRNAseq. No entanto, o ARN total isolado a partir de HDL também pode ser utilizado para quantificar miARNs individuais e outros sRNAs ou validar os resultados sRNAseq utilizando PCR em tempo real umpproaches. Aqui nós descrevemos em detalhe um protocolo para a recolha, purificação, quantificação, análise de dados e validação de alta pureza HDL-sRNAs. O objetivo geral deste trabalho é demonstrar a viabilidade e processo de sRNA quantificação de HDL altamente pura isolada a partir de plasma humano.

<table><tbody><tr><td>Ultracentrífuga</td>Rotor de Ultracentrífuga <td>Beckman Coulter</td><td>A99839</td><td>Optima XPN-80</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>SW-41Ti</td></tr><tr><td>AKTA Pure FPLC System</td><td>GE Healthcare</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>3x FPLC Superdex 200 Colunas de Aumento em Linha</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>10/300 gl</td></tr><tr><td>SynergyMx</td><td>BioTek Instruments</td><td>7191000</td><td></td></tr><tr><td>Tampo de mesa centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004525</td><td>Sorvall ST40R</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>22629867</td><td>5417R (comprada através da USA Scientific)</td></tr><tr><td>Microfuge&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>2631-0006</td><td></td></tr><tr><td>PippenPrep</td><td>Sage Science</td><td>PIP0001</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de DNA de alta sensibilidade</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteca de sequenciamento Kit de quantificação qPCR</td><td>Illumina</td><td>SY-930-1010</td><td></td></tr><tr><td>ProFlex Termociclador</td><td>Applied Biosystems</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12k Flex</td><td>Applied Biosystems</td><td>4471134</td><td></td></tr><tr><td>EpMotion Robot</td><td>Eppendorf</td><td>960000111</td><td>5070</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga ultra-claros</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de Potássio</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P205-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Filtros microcentrífugos 0.45 &micro; m</td> Filtros <td></td> microcentrífugos <td>Millipore</td> UFC30HV00 <td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>miRNAEasy Kits de isolamento de RNA total</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Kit colormétrico de colesterol total</td><td>Cliniqa (Raichem)</td><td>R80035</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de centrifugação de corte de 10.000 m.w.</td><td>Amicon</td><td>UFC801024</td><td>adquirido através</td></tr><tr><td>de tubos de tira de PCR</td><td>Millipore Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td>comprado através de Fisher</td></tr><tr><td>kit de microRNA RT</td><td>Life Technologies</td><td>4366597</td><td>Para 1000 reações</td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Life Technologies</td><td>4440041</td><td>garrafa de 50 mL</td></tr><tr><td>Pierce BCA kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Clean and Concentrator Kit</td><td>Zymo</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálise</td><td>Spectrum Labs</td><td>132118</td><td>adquirido através da Fisher</td></tr><tr><td>bcl2fastq2</td><td>Illumina</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Cutadapt</td><td>https://github.com/marcelm/cutadapt</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>NGSPERL</td><td>github.com/shengqh/ngsperl</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>CQSTools</td><td>github.com/shengqh/CQS.Tools</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Bowtie 1.1.2&nbsp;</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>GeneSpringGX13.1.1</td><td>Agilent</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr></tbody></table>

o isolamento de lipoproteínas de alta densidade para não codificante pequeno arn quantificação

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

A diversidade de pequenos RNAs não-codificantes (sRNA) está se expandindo rapidamente e seu papel nos processos biológicos, incluindo a regulação do gene, estão surgindo. Mais interessante, sRNAs também se encontram fora das células e são estavelmente presente em todos os fluidos biológicos. Como tal, sRNAs extracelular representam uma nova classe de biomarcadores da doença e estão provavelmente envolvidos em redes de comunicação intercelular de sinalização celular e. Para avaliar o seu potencial como biomarcadores, sRNAs podem ser quantificados no plasma, urina e outros fluidos. No entanto, para compreender totalmente o impacto de sRNAs extracelulares como sinais endócrinos, que é importante para determinar que os transportadores são transporte e protegendo-os em fluidos biológicos (por exemplo, plasma), que células e tecidos contribuem para piscinas srna extracelulares, e as células e os tecidos capazes de aceitar e utilizando extracelular sRNA. Para atingir essas metas, é fundamental para isolar populações altamente puras de portadores extracelularessRNA para perfilar e quantificação. Temos anteriormente demonstrado que as lipoproteínas, particularmente lipoproteínas de alta densidade (HDL), o transporte de microRNAs funcionais (miRNA) entre as células e HDL-miRNAs são significativamente alterados na doença. Aqui, nós detalhe um novo protocolo que utiliza conjunto de isolamento HDL com ultracentrifugação em gradiente de densidade (DGUC) and-fast-proteína cromatografia líquida (FPLC) para obter HDL elevado grau de pureza para perfilamento a jusante e quantificação de todos os sRNAs, incluindo miRNAs, usando tanto alta sequenciamento -throughput e em tempo real abordagens de PCR. Este protocolo será um recurso valioso para a investigação de sRNAs sobre HDL.

Este protocolo é uma série de métodos estabelecidos ligados em conjunto para permitir a quantificação de HDL em sRNAs altamente pura por sequenciação de alto rendimento ou PCR em tempo real (Figura 1). Para demonstrar a viabilidade eo impacto deste protocolo, HDL foi purificada a partir de plasma humano pelo conjunto método DGUC e FPLC. As fracções recolhidas correspondentes a FPLC de HDL (colesterol) por distribuição foram concentradas e o ARN total foi isolado a partir...

Este protocolo descreve o isolamento e quantificação de pequenos RNAs de lipoproteína de alta densidade.

O isolamento de lipoproteínas de alta densidade para não codificante pequeno ARN Quantificação

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

O objetivo geral deste protocolo é quantificar RNAs não codificantes pequenos em lipoproteínas purificadas. Este protocolo pode ajudar a responder perguntas-chave na área de lipoproteínas, como definir assinaturas de RNAs pequenos em lipoproteínas na saúde e na doença, além de aprimorar os RNAs pequenos de lipoproteínas como biomarcadores de doenças ou mensagens entre células. A principal vantagem desta técnica é que é possível analisar lipoproteínas altamente puras quanto a alterações nos RNAs pequenos em condições de doença ou experimentais.As implicações dessa técnica se estendem para a terapia de doenças cardiometabólicas, porque os RNAs extracelulares representam uma nova classe de biomarcadores de doenças e os pequenos RNAs das lipoproteínas têm um potencial promissor como alvos terapêuticos em estudos futuros. Embora este método tenha sido desenvolvido para pequenos RNAs do HDL, ele também pode ser adaptado para pequenos RNAs das lipoproteínas de muito baixa densidade e de baixa densidade. Em geral, indivíduos novos neste método podem enfrentar dificuldades devido à falta de equipamentos adequados e de experiência na preparação de amostras para ultracentrifugação em gradiente de densidade.Este protocolo é composto por métodos estabelecidos combinados para a quantificação de RNAs pequenos em HDL altamente puro, utilizando sequenciamento de alto rendimento ou PCR em tempo real. Este vídeo trata da purificação do HDL. Este protocolo será demonstrado pela minha assistente, Evan Shadari.Para começar, adicione 90 microlitros de antioxidantes 100x a nove mililitros de plasma. Em seguida, ajuste a densidade do plasma para 1,025 gramas por mililitro, adicionando 0,251 gramas de brometo de potássio a cada nove mililitros de plasma. Agite suavemente o plasma à temperatura ambiente até que todo o sal tenha se dissolvido.Em seguida, transfira o plasma para tubos de ultracentrífuga, certificando-se de que haja uma camada de bolhas na parte superior. Não deve haver ar aprisionado sob o plasma. A seguir, prepare uma agulha de calibre 18 adicionando uma curvatura de 90 graus a um centímetro da ponta, com o lado biselado voltado para cima.Em seguida, utilizando uma seringa e a agulha curvada, coloque cuidadosamente três mililitros da solução de sobrecamada número um sobre o plasma. Remova a maioria das bolhas na superfície e deixe de dois a três milímetros entre o menisco e a borda do tubo. Em seguida, coloque cuidadosamente os tubos nos baldes do rotor SW 40 Ti.Pese cada balde com as tampas e equilibre exatamente os baldes que ocuparão posições opostas na centrífuga. Em seguida, coloque o rotor na ultracentrífuga e execute a 274.400 ×g por 24 horas a quatro graus Celsius, com o freio ajustado intermediariamente em um valor de quatro. No dia seguinte, remova cuidadosamente os baldes do rotor e retire os tubos dos baldes.Em seguida, remova lentamente dois mililitros da camada superior do sobrenadante, utilizando uma seringa e agulha curva. Esta é a fração VLDL IDL. Depois, colete os sete mililitros restantes do plasma e transfira para um tubo cônico de 15 mililitros.Complete o volume do plasma até nove mililitros adicionando a solução de sobreposição número dois. Em seguida, ajuste a densidade para 1,080 gramas por mililitro adicionando 0,746 gramas de brometo de potássio. Depois, agite suavemente a amostra para dissolver o sal, o que levará cerca de 20 minutos.Em seguida, transfira a amostra para um tubo de ultracentrífuga sem aprisionar ar. Certifique-se de que uma camada de bolhas seja formada no topo. Usando a agulha curva, sobreponha cuidadosamente três mililitros da solução de sobreposição número três.Em seguida, remova a maior parte das bolhas e carregue cuidadosamente os tubos no rotor SW 40 Ti. Equilibre-os e centrifugue-os, como descrito anteriormente, por 24 horas. No dia seguinte, remova cuidadosamente dois mililitros da camada superior do sobrenadante utilizando a agulha curvada.Esta é a fração de LDL. Em seguida, transfira a amostra restante para um novo tubo cônico de 15 mililitros e complete o volume até nove mililitros com a solução número quatro. Agora, ajuste a densidade para 1,30 gramas por mililitro adicionando cerca de 3,33 gramas de brometo de potássio e agitando suavemente a amostra até que o sal se dissolva.Em seguida, transfira a amostra para um tubo de ultracentrífuga e sobreponha cuidadosamente três mililitros da solução número cinco. Agora, submeta a amostra à ultracentrifugação como anteriormente, mas por 48 horas. Dois dias depois, colete os dois mililitros superiores da camada sobrenadante utilizando uma seringa e uma agulha curvada.Isso constitui a fração de HDL. Para remover as soluções com alta concentração de sal, transfira a fração de HDL para uma membrana de diálise úmida com corte de peso molecular de 10.000. Em seguida, realize a diálise durante 24 horas em um litro de XPBS 1x com agitação suave a quatro graus Celsius.Substitua a solução de PBS três vezes durante o período de 24 horas. Posteriormente, determine a concentração de proteína da fração de HDL utilizando o método de BCA. Vesículas extracelulares, ou exossomos, possuem uma densidade semelhante à do HDL pequeno e, portanto, poderiam estar presentes na mesma fração de densidade que o HDL.Assim, a fração de HDL requer purificação adicional por FPLC. Imediatamente antes de usar o FPLC, aplique 1,2 miligramas da fração de HDL do DGUC em 500 microlitros de solução através de um filtro centrífugo de 0,22 mícrons. Colete a amostra filtrada em uma seringa de injeção para FDLC, garantindo que nenhuma bolha de ar fique aprisionada.A seguir, ajuste a vazão do FPLC para 0,3 mililitros por minuto com um limite de pressão de 2,6 megapascais. Em seguida, equilibre as colunas com 0,2 volumes da coluna de tampão. Agora, injete a amostra com três mililitros de tampão no instrumento de FPLC e inicie a corrida.Coletar frações de 1,5 mililitro por um total de 72 frações. Identificar as frações de FPLC correspondentes ao HDL-DGUC mediante a determinação dos níveis totais de colesterol utilizando um kit colorimétrico de acordo com as instruções do fabricante. Espera-se encontrar seis a sete frações de FPLC contendo HDL-DGUC.Agrupe todas as frações contendo HDL e concentre-as usando um filtro centrífugo com corte de 10 kilodaltons a 4.000 × g durante uma hora a quatro graus Celsius, ou até que o concentrado de HDL tenha aproximadamente 100 microlitros. Em seguida, colete o concentrado de HDL e quantifique a proteína utilizando o método BCA. Posteriormente, utilize a mesma quantidade de proteína total de HDL para isolar o RNA.O plasma humano foi fracionado por FPLC sem o uso de separação em gradiente de densidade. Seis frações corresponderam a HDL e seis a lipoproteína de muito baixa densidade. Os lipídios em preto, o colesterol em vermelho e as proteínas em azul foram todos medidos por meio de kits colorimétricos.Por comparação, o uso da ultracentrifugação em gradiente de densidade antes da FPLC resultou na detecção de proteína lipídica e colesterol quase exclusivamente nas frações de HDL. A partir do HDL obtido de quatro doadores plasmáticos saudáveis, o RNA total foi isolado e sequenciado utilizando um protocolo de leitura única com 50 pares de bases. A distribuição das leituras normalizadas ilustra um enriquecimento de RNAs pequenos em torno de 21 e 34 nucleotídeos.A análise da biblioteca mostrou que 38 por cento das leituras eram microRNAs, e 37 por cento eram derivadas de tRNAs. RNAs diversos, RNAs ribossomais, pequenos RNAs, pequenos RNAs nucleolares e RNAs não codificantes longos também estavam presentes. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em até dez dias, quando executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de validar as alterações observadas na sequenciação de alto rendimento de RNAs pequenos de HDL com outro método, como PCR ou hibridização em membrana (northern blotting). Após este procedimento, outros métodos, como a capacidade de aceitação de efluxo de colesterol pela HDL e os ensaios anti-inflamatórios da HDL, podem ser realizados durante as etapas de isolamento de RNA e preparação para sequenciamento, a fim de responder perguntas adicionais, como determinar a correlação entre as alterações nos RNAs pequenos da HDL e a função da HDL. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de lipídios e lipoproteínas estudarem cargas não relacionadas ao colesterol, particularmente ácidos nucleicos e doenças metabólicas, por exemplo hipercolesterolemia ou diabetes.E não se esqueça: trabalhar com plasma humano pode ser extremamente perigoso, e é necessário ter treinamento adequado em patógenos transmitidos pelo sangue, além de usar equipamentos de proteção individual apropriados ao realizar esta técnica.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Rápido e simplificado método para isolamento alto Através-put de miRNA de altamente purificada lipoproteína de alta densidade

Fatores epigenéticos podem interagir com programas genéticos para modular a expressão gênica e regulam a função de células B. Combinando a estimulação de vitro em células B, qRT-PCR e elevado-throughput do microRNA-sequência e abordagens de RNAm-sequência, podemos analisar a epigenética modulação da expressão de gene e miRNA em células B.

Genoma-largo mediada por análise de inibidor HDAC modulação de microRNAs e mRNAs em B células induzidas a recombinação de DNA de classe-interruptor sofrem e diferenciação de células plasmáticas

gotículas lipídicas são organelos importantes para a replicação de vários agentes patogénicos, incluindo o vírus da hepatite C (HCV). Descreve-se um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas; ele pode ser utilizado sob uma variedade de condições, tais como infecção por vírus, stress ambiental, ou tratamento com droga.

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Enriquecimento de partículas de lipoproteína nativa com microRNA e subsequente determinação de seu conteúdo de microRNA absoluto/relativo e sua taxa de transferência celular

Este protocolo fornece um método eficiente de digestão de colagenase para isolamento de adipócitos viáveis e células da fração vascular estromal-SVF da gordura visceral humana em um único processo, incluindo metodologia para obtenção de RNA de alta qualidade a partir de adipócitos e fenotipificação de macrófagos SVF através da coloração de múltiplos marcadores ligados à membrana para análise por citometria de fluxo.

Isolamento de Adipócitos Viáveis e Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Visceral Humano Adequado para Análise de RNA e Fenotipagem de Macrófagos

Aprenda a isolar lipoproteínas de alta densidade e quantificar pequenos RNAs não codificantes usando ultracentrifugação em gradiente de densidade. Este método avança o potencial dessas moléculas como biomarcadores em doenças cardiometabólicas.

O isolamento de lipoproteínas de alta densidade para não codificante pequeno ARN Quantificação

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