O isolamento de lipoproteínas de alta densidade para não codificante pequeno ARN Quantificação

O objetivo geral deste protocolo é quantificar pequenos RNAs não codificantes em lipoproteínas purificadas. Este protocolo pode ajudar a responder a questões-chave no campo da lipoproteína, como definir assinaturas de pequenos RNAs de lipoproteínas na saúde e na doença, bem como avançar os pequenos RNAs de lipoproteínas como biomarcadores de doenças ou mensagens célula a célula. A principal vantagem desta técnica é que se pode analisar lipoproteínas altamente puras para pequenas alterações de RNA em doenças ou condições experimentais.

As implicações dessa técnica se estendem para a terapia de doenças cardiometabólicas, porque os RNAs extracelulares são uma nova classe de biomarcadores de doenças e o RNA pequeno da lipoproteína possui um potencial empolgante como alvos de drogas em estudos futuros. Embora este método seja projetado para pequenos RNAs HDL, ele também pode ser adaptado para pequenos RNAs de lipoproteínas de densidade muito baixa e baixa densidade. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, devido à falta de equipamento adequado e experiência na preparação de amostras para ultracentrifugação com gradiente de densidade.

Este protocolo é composto por métodos estabelecidos ligados entre si para a quantificação de pequenos RNAs em HDL altamente puro, usando sequenciamento de alto rendimento ou PCR em tempo real. Este vídeo trata da purificação do HDL. Este protocolo será demonstrado pelo meu assistente, Evan Shadari.

Para começar, adicione 90 microlitros de antioxidantes 100x a nove mililitros de plasma. Em seguida, ajuste a densidade do plasma para 1,025 gramas por mililitro, adicionando 0,251 gramas de brometo de potássio a cada nove mililitros de plasma. Agite o plasma à temperatura ambiente, até que todo o sal se dissolva.

Em seguida, transfira o plasma para tubos de ultracentrífuga e certifique-se de ter uma camada de bolhas no topo. Não deve haver ar preso sob o plasma. Em seguida, prepare uma agulha de calibre 18 adicionando uma curva de 90 graus a um centímetro da ponta, com o lado chanfrado voltado para cima.

Em seguida, usando uma seringa e a agulha dobrada, coloque cuidadosamente três mililitros da solução de sobreposição número um no plasma. Remova a maioria das bolhas da superfície e deixe de dois a três milímetros entre o menisco e a borda do tubo. Em seguida, coloque cuidadosamente os tubos em baldes SW 40 Ti.

Pese cada balde com as tampas e equilibre exatamente os baldes que ocuparão posições opostas na centrífuga. Em seguida, coloque o rotor na ultracentrífuga e opere-o a 274.400 vezes G por 24 horas a quatro graus Celsius, com a quebra ajustada intermediáriamente em um valor de quatro. No dia seguinte, remova cuidadosamente os baldes do rotor e levante os tubos dos baldes.

Em seguida, remova lentamente dois mililitros da camada superior da cobertura, usando uma seringa e uma agulha dobrada. Esta é a fração VLDL IDL. Em seguida, colete os sete mililitros restantes de plasma e transfira-os para um tubo cônico de 15 mililitros.

Aumente o volume do plasma para nove mililitros adicionando a solução de sobreposição número dois. Em seguida, ajuste a densidade para 1,080 gramas por mililitro adicionando 0,746 gramas de brometo de potássio. Em seguida, agite suavemente a amostra para dissolver o sal, o que levará cerca de 20 minutos.

Em seguida, transfira a amostra para um tubo de ultracentrífuga sem reter o ar. Certifique-se de que uma camada de bolhas seja feita no topo. Usando a agulha dobrada, cubra cuidadosamente três mililitros da solução de sobreposição número três.

Em seguida, remova a maioria das bolhas e carregue cuidadosamente os tubos no balde SW 40 Ti. Equilibre-os e gire-os, conforme descrito anteriormente, por 24 horas. No dia seguinte, remova cuidadosamente dois mililitros da camada superior da sobreposição usando a agulha dobrada.

Esta é a fração LDL. Em seguida, transfira a amostra restante para um novo tubo cônico de 15 mililitros e aumente o volume para nove mililitros com a solução número quatro. Agora ajuste a densidade para 1,30 gramas por mililitro adicionando cerca de 3,33 gramas de brometo de potássio e balançando a amostra até que o sal se dissolva.

Em seguida, transfira a amostra para um tubo de ultracentrífuga e cuidadosamente três mililitros da solução número cinco. Agora, ultracentrifugue a amostra como antes, mas por 48 horas. Dois dias depois, colete os dois mililitros superiores da cobertura usando uma seringa e uma agulha dobrada.

Isso constitui a fração HDL. Para remover as soluções com alto teor de sal, transfira a fração HDL para uma manga de diálise úmida com um corte de 10.000 pesos moleculares. Em seguida, dialise-o por 24 horas em um litro de um XPBS com agitação suave a quatro graus Celsius.

Substitua a solução PBS três vezes durante o período de 24 horas. Posteriormente, determinar a concentração proteica da fração HDL usando um método BCA. As vesículas extracelulares, ou exossomos, têm uma densidade semelhante ao HDL pequeno e, portanto, podem estar presentes na mesma fração de densidade que o HDL.

Assim, a fração HDL requer purificação adicional por FPLC. Imediatamente antes de usar o FPLC, execute 1.2 miligramas da fração DGUC HDL em 500 microlitros de solução através de um filtro centrífugo de 0.22 mícron. Colete a amostra filtrada em uma seringa de injeção FDLC, garantindo que nenhuma bolha de ar fique presa.

Em seguida, defina a taxa de fluxo FPLC para 0.3 mililitros por minuto com um limite de pressão em 2.6 megapascais. Em seguida, equilibre as colunas com 0,2 volumes de coluna de buffer. Agora injete a amostra com três mililitros de tampão no instrumento FPLC e inicie a execução.

Colete frações de 1,5 mililitro para um total de 72 frações. Identifique as frações FPLC correspondentes ao DGUC HDL determinando os níveis de colesterol total usando um kit colorimétrico de acordo com as instruções do fabricante. Espere encontrar de seis a sete frações de FPLC contendo DGUC HDL.

Agrupe todas as frações contendo HDL e concentre-as usando um filtro centrífugo de corte de 10 kilodalton a 4.000 vezes G por uma hora a quatro graus Celsius, ou até que o concentrado de HDL seja de aproximadamente 100 microlitros. Em seguida, colete o concentrado de HDL e quantifique a proteína usando o método BCA. Posteriormente, use a mesma quantidade de proteína total HDL para isolar o RNA.

O plasma humano foi fracionado por FPLC sem o uso de separação densidade-gradiente. Seis frações corresponderam à HDL e seis à lipoproteína de densidade muito baixa. Lipídios em preto, colesterol em vermelho e proteína em azul foram todos medidos por kits colorimétricos.

Em comparação, o uso de ultracentrifugação de gradiente de densidade antes do FPLC resultou na descoberta de proteína lipídica e colesterol quase exclusivamente nas frações de HDL. A partir de HDL retirado de quatro doadores de plasma saudáveis, o RNA total foi isolado e sequenciado usando um protocolo de 50 pares de bases de leitura única. A distribuição de leituras normalizadas ilustra o enriquecimento de pequenos RNAs em torno de 21 e 34 nucleotídeos.

A análise da biblioteca mostrou que 38% das leituras eram micro RNAs e 37% eram derivadas de TRNAs. RNAs diversos, RNAs ribossômicos, RNAs pequenos, RNAs nucleolares pequenos e RNAs longos não codificantes também estavam presentes. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em até dez dias, quando feita corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de validar as pequenas alterações de RNA HDL observadas com sequenciamento de alto rendimento com outro método, como PCR ou northern blotting. Após este procedimento, outros métodos, como a capacidade de aceitação do e-flux de colesterol HDL e os SAs anti-inflamatórios HDL, podem ser realizados durante as etapas de isolamento de RNA e etapas de preparação de sequenciamento para responder a perguntas adicionais, como determinar a correlação entre pequenas alterações de RNA HDL e função HDL. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de lipídios e lipoproteínas, estudarem cargas não relacionadas ao colesterol, particularmente ácidos nucléicos e doenças metabólicas, por exemplo, hipercolesterolemia ou diabetes.

E não se esqueça, trabalhar com plasma humano pode ser extremamente perigoso, e deve-se ter treinamento adequado em patógenos transmitidos pelo sangue, e equipamento de proteção individual apropriado deve ser usado ao realizar esta técnica.