Name: Visualização do Sistema Nervoso embrionárias no Whole-mount Drosophila Os embriões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprenda a preparar embriões de Drosophila para visualização do sistema nervoso embrionário por imunofluorescência. Este protocolo utiliza coloração com anticorpos primários e secundários para estudar a organização neuronal em desenvolvimento.

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SG é apoiado por fundos da Universidade Estadual de Nova York em Buffalo e de John R. Oishei Foundation.

1. Preparação dos Reagentes <ol><li> Prepare o Buffer PEMFA usando Pipes 100mM, 2mM EGTA, e 1 mM MgSO 4. Ajustar o pH do tampão a 7,0. O buffer PEMFA é esterilizado por filtração e armazenado a 4 ° C. </li><li> Prepare PBT, adicionando 1 ml de Triton X-100 a 100ml 1x PBS (Phosphate Buffered Saline) (pH 7,0). Armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare BSA 5% (albumina bovina) com NaAcide 0,01% em 1x PBS (pH 7,0). </li><li> Prepare a solução salina usando 0,7% de NaCl e 0,03% Triton X-100 em água deionizada. </li><li> Prepare o fixador, combinando quatro partes tampão PEMFA com 1 parte de formaldeído 37%. </li></ol> 2. Coleta de embriões <ol><li> Prepare uma gaiola para a cepa Drosophila de interesse, colocando&gt; 100 moscas em uma garrafa de plástico contendo um adaptador de alimentação com placa de agar. </li><li> Deixe a gaiola de moscas no escuro à temperatura ambiente por 72 horas, mudando as placas a cada 8-12 horas, de modo que as moscas se acostumar à gaiola e não mantenha seus ovos. </li><li> Para o experimento coletar embriões para 12 horas. Remova a placa de Petri do recipiente e substituí-lo. Pegue a placa de Petri removido e lavar os embriões fora do prato utilizando a solução salina e um pincel limpo. </li><li> Coletar os embriões em uma peneira fina. Enxaguar com soro fisiológico para remover qualquer excesso de levedura. </li><li> Usando uma espátula delicadamente pegar os embriões e colocá-las num frasco de vidro pequeno com tampa. Adicionar cerca de 1ml de solução salina. </li></ol> 3. Remoção das membranas Chorion e Vitelline e Fixação <ol><li> Após a coleta dos embriões, preparar a solução de heptano-Fix, combinando 50% heptano e fixador de 50%. A solução será em camadas com heptano na parte superior eo fixador na parte inferior. </li><li> No frasco de vidro de lavagem dos embriões, incubando-as na solução salina por 5 minutos. Remover salina em excesso com uma pipeta Pasteur. </li><li> Enxágüe os embriões com água deionizada. </li><li> Dechorionate os embriões, incubando-as em água sanitária 50% por 3 minutos. </li><li> Enxágüe os embriões cuidadosamente com água deionizada. </li><li> Fixar os embriões, incubando-as por 30 minutos na solução de heptano-Fix, agitando suavemente. </li><li> Com uma pipeta Pasteur substituir o (camada inferior) fixador com metanol deixando o heptano no tubo. Agite vigorosamente para remover a membrana vitelina. Os embriões devitellinized vai afundar até o fundo do tubo. </li><li> Coletar os embriões em um frasco de vidro novo, utilizando uma pipeta Pasteur. Enxágüe os embriões cinco vezes com metanol, cada vez incubar os embriões por 5 minutos. </li></ol> 4. Coloração de anticorpos, montagem, e Visualização <ol><li> Hidratar os embriões em uma mistura de 50% de solução PBT e metanol 50% por 5 minutos. Em seguida, hidratar em 100% PBT solução por 5 minutos. </li><li> Bloco os embriões, incubando-as em BSA 5% com a solução NaAcide 0,01% para 1 hora a 4 ° C. </li><li> Embriões estão agora prontos para a coloração de anticorpos. Prepare o anticorpo primário, diluindo-lo para a concentração adequada usando BSA 5% com a solução NaAcide 0,01%. Nós usamos um anticorpo contra a proteína cadeia cisteína (CSP), uma proteína vesicular sináptica e um anti-anticorpo HRP ou cavalo peroxidase de rabanete, que reconhece uma porção específica de carboidratos neuronal presente no glicoproteínas de superfície e etiquetas todos os neurônios. </li><li> Incubar os embriões durante a noite a 4 ° C na solução de anticorpo primário. </li><li> No dia seguinte, lave os embriões 10 vezes com PBT ao longo de uma hora. </li><li> Preparar a solução de anticorpo secundário diluindo a concentração adequada. Usamos anticorpos Alexa secundário na concentração de 1:200. </li><li> Incubar os embriões durante duas horas no 4 ° C na solução de anticorpo secundário. </li><li> Lavar os embriões 10 vezes com PBT ao longo de uma hora. </li><li> Incubar os embriões durante a noite em Vectashield Meio de Montagem. </li><li> Monte os embriões em uma lâmina de vidro e selar a lamínula com unha polonês. Visualize embriões utilizando um microscópio de fluorescência. </li></ol> 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1a.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1b.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> HRP-FITC <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1c.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Fundiram Figura 1: A Representante imagens mostrando o SNC na fase embrionária 16-17, utilizando anticorpos contra o CSP (vermelho) e HRP (verde). Observe a coloração distinta da comissura. <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2a.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2b.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> HRP-FITC "/&gt; Fundiram Figura 2: Um representante de imagens mostrando o PNS embrionárias na fase 16-17 usando anticorpos contra o CSP (vermelho) e HRP (verde). Observe a padrões repetidos de neurônios periféricos.

<ol><li>Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+sensory+organs+by+mutations+of+the+cut+locus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster.</a> Cell. 51, 293-307 (1987).</li>
<li>Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+of+the+peripheral+nervous+system+in+Drosophila+embryos%3A+DNA+replication+patterns+and+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages.</a> Neuron. 3, 21-32 (1989).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. New York. (1985).</li>
<li>Carroll, S. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+fushi+tarazu+protein+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis.</a> Cell. 43, 47-57 (1985).</li>
<li>Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+connections+between+imaginal+discs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle connections between imaginal discs in Drosophila.</a> Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O embrião Drosophila é um sistema poderoso para investigar as mudanças celulares e moleculares durante o desenvolvimento neuronal. Neste protocolo temos demonstrado como preparar embriões montar toda a imuno-histoquímica. Nós adaptamos este protocolo a partir do protocolo descrito no Carroll e Scott, 1985. Este protocolo também pode ser adaptado para testar outros anticorpos neuronal, mas a otimização de anticorpos deve ser feito. Além disso, defeitos de desenvolvimento do PNS embrionárias e sistema nervoso cen...

<table><tbody><tr><td>formaldeído 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-25</td><td></td></tr><tr><td>CSP</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>323-095-021</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Anti-Rato IgG de Cabra</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Montagem Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização do sistema nervoso embrionárias no whole-mount drosophila os embriões

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

O embrião Drosophila é um sistema modelo atraente para investigar as bases celulares e moleculares do desenvolvimento neuronal. Aqui nós descrevemos o procedimento para a visualização de Drosophila sistema nervoso embrionário utilizando anticorpos para proteínas neuronal. Uma vez que todo o embrião nervoso periférico e sistema nervoso central estão bem caracterizados no nível de células individuais (Dambly-Chaudière et al, 1986;.. Bodmer et al, 1987;. Bodmer et al, 1989), qualquer aberrações para estes sistemas podem ser facilmente identificados através de anticorpos para diferentes proteínas neuronal. Os embriões em desenvolvimento são coletados em determinados momentos para garantir que os embriões estão em fase de desenvolvimento adequado para visualização. Após a coleta, as camadas externas do embrião, a membrana cório eo envelope vitelínico que envolve o embrião, são removidos antes da fixação. Embriões são então incubados com anticorpos neuronal e visualizados usando fluorescente etiquetado anticorpos secundários. Embriões em estágios 12-17 são visualizados para acessar o sistema nervoso embrionário. No estágio 12 a banda germe CNS começa encurtamento e por etapa 15, o padrão definitivo da comissura foi alcançado. Por estágio 17 os contratos do SNC e do SNP está totalmente desenvolvido (Campos-Ortega et al. 1985). Assim, mudanças no padrão do PNS e sistema nervoso central pode ser facilmente observado durante estes estágios de desenvolvimento.

Nós descrevemos o procedimento para preparar encenado<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões para a visualização do sistema nervoso embrionário durante a embriogênese.

Visualização do Sistema Nervoso embrionárias no Whole-mount Drosophila Os embriões

O embrião de Drosophila é um sistema modelo atraente para investigar a base celular e molecular do desenvolvimento neuronal. Aqui, descrevemos o...

O objetivo geral deste procedimento é preparar embriões de oph e melanogaster para a visualização em montagem inteira do sistema nervoso. Isso é realizado primeiramente coletando embriões da linhagem de moscas de interesse. O segundo passo do procedimento consiste em remover o cório com água sanitária.O terceiro passo do procedimento é aplicar heptano e metanol para remover a membrana vilina. O passo final do procedimento é aplicar anticorpos aos embriões. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a estrutura do sistema nervoso do embrião de drosófila por meio de microscopia de imunofluorescência.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurociência, como qual papel as mutações podem desempenhar no sistema nervoso em desenvolvimento. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque podem acidentalmente aspirar embriões para fora do frasco. Inicie este protocolo preparando os reagentes necessários, incluindo P-E-M-F-A, tampão PBC com solução salina contendo 5% de BSA e 0,01% de azida sódica e fixador de formaldeído.Prepare uma gaiola para a linhagem de drosófila de interesse anestesiando as moscas com dióxido de carbono e, em seguida, transferindo pelo menos 100 moscas para uma garrafa de plástico contendo um adaptador com uma placa de alimentação de ágar suco de maçã. Coloque a gaiola com as moscas no escuro, à temperatura ambiente, por 72 horas. Troque as placas de alimentação de ágar suco de maçã a cada oito a 12 horas para que as moscas se aclimatizem à gaiola e não retenham seus ovos para o experimento.Após o período de aclimatação de 72 horas, colete os embriões 12 horas após a última troca da placa de alimentação com ágar suco de maçã. Remova a placa de alimentação com ágar suco de maçã da gaiola de postura e substitua-a usando solução salina. Enxágue a placa de alimentação com ágar suco de maçã.Colete os embriões em uma peneira fina. Use um pincel limpo para soltar quaisquer embriões que permaneçam grudados na placa. Enxágue os embriões na peneira com solução salina para remover qualquer excesso de levedura usando uma espátula, levante suavemente os embriões e coloque-os em um pequeno frasco de vidro.Adicione cerca de um mililitro de solução salina. Em seguida, tampe o frasco e incube por cinco minutos para lavar os embriões. Após a coleta dos embriões.Prepare a solução fixadora com heptano combinando 50% de heptano e 50% de fixador. A solução será estratificada, com heptano na camada superior e o fixador na camada inferior. Após cinco minutos, utilize uma pipeta de pasta para remover o excesso de salina do frasco de vidro contendo os embriões.Lave os embriões com água desionizada aplicando aproximadamente um mililitro de água desionizada no frasco de vidro contendo os embriões. Deixe os embriões em repouso por um minuto antes de remover a água com uma solução de hipoclorito a 50%. Agite o frasco algumas vezes manualmente e, em seguida, incube por três minutos para revestir os embriões.Os embriões desovados afundarão até o fundo do frasco. Os CORs embrionários flutuarão. Remova o hipoclorito e os CORs após a incubação de três minutos.Após a desovulação, lave bem os embriões com água desionizada, aplicando aproximadamente um mililitro de água desionizada no vial de vidro contendo os embriões. Deixe os embriões repousarem por um minuto antes de remover a água residual; os CORs remanescentes flutuarão e devem ser removidos. Adicione a solução de fixação com heptano aos embriões e incube-os por 30 minutos sob agitação suave para fixá-los após a fixação.Use uma pipeta Pasteur para remover o fixador, que é a camada inferior, deixando o heptano no tubo. Em seguida, adicione metanol novamente ao fundo do tubo no lugar do fixador e tampe o tubo; agite vigorosamente à mão para remover a membrana vitelina. Após esta etapa, os embriões fixados irão ao fundo do tubo.Usando uma pipeta de pasta, remova o metanol e os hets do frasco, deixando para trás os embriões desionizados. Em seguida, lave os embriões cinco vezes com metanol, removendo o metanol com uma pipeta de pasta entre cada lavagem. Para cada lavagem, incube os embriões por cinco minutos.Coloque os embriões em uma mistura de solução PBT 50% e metanol 50% durante cinco minutos para reidratá-los. Em seguida, prossiga o processo de reidratação transferindo-os para solução PBT 100% por cinco minutos. A seguir, bloqueie os embriões incubando-os em BSA 5% com solução de azida de sódio 0,01% por uma hora a quatro graus Celsius.Em seguida, prepare o anticorpo primário para coloração de embriões diluindo-o até a concentração apropriada usando solução de BSA 5% com azida sódica 0,01%. Os anticorpos utilizados aqui são direcionados contra a proteína vesicular de cadeia de cisteína e o anticorpo anti-HRP. O anti-HRP reconhece uma porção carboidrata específica neural presente em glicoproteínas de superfície, que marca todos os neurônios.Incube os embriões durante a noite a quatro graus Celsius na solução de anticorpo primário. Lave os embriões 10 vezes com PBT ao longo de uma hora. Aplicando aproximadamente um mililitro de PBT ao frasco de vidro contendo os embriões, deixe os embriões em repouso por seis minutos antes de remover o PBT.Repita este processo de aplicação de PBT, incubação e remoção de PBT dez vezes. Prepare a solução de anticorpo secundário no escuro, pois é sensível à luz, diluindo até a concentração apropriada. Utilizamos anticorpos secundários Alexa numa concentração de um para 200.Incube os embriões por duas horas a quatro graus Celsius na solução de anticorpo secundário. Envolva o frasco de vidro contendo os embriões e a solução de anticorpo secundário com papel alumínio para evitar exposição à luz. Lave os embriões 10 vezes com PBT ao longo de uma hora.Adicione meio de montagem com vetor protetor aos embriões e incube-os durante a noite a quatro graus Celsius para montagem. Use uma pipeta pastel para aspirar os embriões junto com um pouco do meio de montagem. Aplique os embriões e o meio em uma lâmina de vidro.Coloque uma lamínula sobre os embriões e selar a lamínula com esmalte. Visualize os embriões utilizando um microscópio de fluorescência aqui. O SNC embrionário é mostrado nas fases 16 a 17.A proteína da cadeia de cistina é mostrada em vermelho. Os neurônios HRP são mostrados em verde. Observe a coloração distinta do comissura nesta imagem representativa.O SNP embrionário é mostrado no estágio 16 a 17. Novamente, a proteína da cadeia de cistina é mostrada em vermelho, e os neurônios são mostrados em verde. Observe os padrões repetidos de neurônios periféricos.Ao tentar este procedimento, é importante ter cuidado com os embriões para não removê-los acidentalmente do frasco. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar embriões oph fla para a visualização em montagem inteira do sistema nervoso.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Drosophila melanogaster larvas fornecer um modelo de sistema ideal para investigar os mecanismos de transporte axonal dentro larval nervos segmentares. Usando este procedimento, 3 de larvas portadores de mutações diferentes podem ser comparadas às larvas do tipo selvagem.

Visualização de Larval Nervos segmentar em 3 Rd Instar Drosophila Preparações larval

Aqui apresentamos um protocolo de montagem para...

Imagem vertical de Drosophila Os embriões

Fonte: Jeong, S. Visualização do padrão de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a visualização de projeções axonais em embriões Drosophila. A imunomarcação de neurônios motores, a dissecção precisa para expor estruturas neuronais e a microscopia de contraste de interferência diferencial revelam coletivamente a arquitetura neuronal detalhada, enfatizando os padrões de projeção axonal.

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A imunocoloração é uma técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células e proteínas dentro dos tecidos. Ao utilizar a sonicação, o protocolo descrito aqui alivia a necessidade de dissecar tecidos de Drosophila melanogaster de embriões e larvas em estágio avançado antes da imunocoloração. Fornecemos uma metodologia eficiente para a imunocoloração de larvas de montagem inteira fixadas em formaldeído.

Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos<em&gt; In Situ</em

Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados.

Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

Nós descrevemos um protocolo para dissecação, fixação e imunocoloração de órgãos esteroidogênicas em Drosophila larvas e adultos do sexo feminino para estudar a biossíntese de hormônios esteróides e seu mecanismo de regulação. Em adição aos órgãos esteroidogênicas, podemos visualizar a inervação dos órgãos esteroidogênicas, bem como células alvo esteroidogênicas, tais como células estaminais da linha germinal.

Protocolos para a visualização de esteroidogênicas Órgãos e seus órgãos interativa com imunocoloração na mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este trabalho detalha um método de imuno-histoquímica padrão para visualizar as projeções de neurônios motores de embriões de Drosophila melanogaster em estágio final 16. A preparação em fileira de embriões fixos corados com anticorpo FasII fornece uma ferramenta poderosa para caracterizar os genes necessários para a identificação do axônio do motor e o reconhecimento do alvo durante o desenvolvimento neural.

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