Visualização do Sistema Nervoso embrionárias no Whole-mount Drosophila Os embriões
11 de dezembro de 2010
Nós descrevemos o procedimento para preparar encenado Drosophila Embriões para a visualização do sistema nervoso embrionário durante a embriogênese.
O objetivo geral deste procedimento é preparar embriões de oph e melanogaster para a visualização em montagem inteira do sistema nervoso. Isso é realizado primeiramente coletando embriões da linhagem de moscas de interesse. O segundo passo do procedimento consiste em remover o cório com hipoclorito de sódio.
O terceiro passo do procedimento é aplicar heptano e metanol para remover a membrana vilina. O passo final do procedimento é aplicar anticorpos aos embriões. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a estrutura do sistema nervoso do embrião de drosófila por meio de microscopia de imunofluorescência.
Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurociência, como qual papel as mutações podem desempenhar no sistema nervoso em desenvolvimento. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque podem acidentalmente aspirar embriões do frasco. Inicie este protocolo preparando os reagentes necessários, incluindo P-E-M-F-A, tampão PBC com solução salina contendo 5% de BSA e 0,01% de azida sódica e fixador de formaldeído.
Prepare uma gaiola para a linhagem de drosófila de interesse anestesiando as moscas com dióxido de carbono e, em seguida, transferindo pelo menos 100 moscas para um frasco plástico contendo um adaptador com uma placa de alimentação de ágar suco de maçã. Coloque a gaiola com as moscas no escuro, à temperatura ambiente, por 72 horas. Troque as placas de alimentação de ágar suco de maçã a cada oito a 12 horas para que as moscas se aclimatizem à gaiola e não retenham seus ovos para o experimento.
Após o período de aclimatação de 72 horas, colete os embriões 12 horas após a última troca da placa de alimentação com ágar suco de maçã. Remova a placa de alimentação com ágar suco de maçã da gaiola de postura e substitua-a usando solução salina. Enxágue a placa de alimentação com ágar suco de maçã.
Colete os embriões em uma peneira fina. Use um pincel limpo para soltar quaisquer embriões que permaneçam grudados na placa. Enxágue os embriões na peneira com solução salina para remover qualquer excesso de levedura usando uma espátula, levante suavemente os embriões e coloque-os em um pequeno frasco de vidro.
Adicione cerca de um mililitro de solução salina. Em seguida, tampe o frasco e incube por cinco minutos para lavar os embriões. Após a coleta dos embriões.
Prepare a solução fixadora com heptano combinando 50% de heptano e 50% de fixador. A solução será estratificada com heptano na camada superior e o fixador na camada inferior. Após cinco minutos, utilize uma pipeta de pasta para remover o excesso de salina do frasco de vidro contendo os embriões.
Lave os embriões com água desionizada aplicando aproximadamente um mililitro de água desionizada no frasco de vidro contendo os embriões. Deixe os embriões em repouso por um minuto antes de remover a água com uma solução de hipoclorito a 50%. Agite o frasco algumas vezes manualmente e, em seguida, incube por três minutos para revestir os embriões.
Os embriões desovados afundarão até o fundo do frasco. Os CORs embrionários flutuarão. Remova o hipoclorito e os CORs após a incubação de três minutos.
Após a decoração, lave bem os embriões com água desionizada, aplicando aproximadamente um mililitro de água desionizada no frasco de vidro contendo os embriões. Deixe os embriões repousarem por um minuto antes de remover a água residual; os CORs remanescentes flutuarão e devem ser removidos. Adicione a solução fixadora de heptano aos embriões e incube-os por 30 minutos sob agitação suave para fixá-los após a fixação.
Use uma pipeta Pasteur para remover o fixador, que é a camada inferior, deixando o heptano no tubo. Em seguida, adicione metanol novamente até o fundo do tubo, no lugar do fixador, e tampe o tubo; agite vigorosamente à mão para remover a membrana vitelina. Após esta etapa, os embriões fixados afundarão até o fundo do tubo.
Usando uma pipeta de pasta, remova o metanol e os heteros do vial, deixando para trás os embriões desionizados. Em seguida, lave os embriões cinco vezes com metanol, removendo o metanol com uma pipeta de pasta entre cada lavagem. Para cada lavagem, incube os embriões por cinco minutos.
Coloque os embriões em uma mistura de solução PBT a 50% e metanol a 50% durante cinco minutos para reidratá-los. Em seguida, prossiga com o processo de reidratação transferindo-os para solução PBT a 100% durante cinco minutos. A seguir, bloqueie os embriões incubando-os em BSA a 5% com solução de azida de sódio a 0,01% durante uma hora a quatro graus Celsius.
Em seguida, prepare o anticorpo primário para coloração de embriões diluindo-o até a concentração apropriada usando solução de BSA 5% com azida sódica 0,01%. Os anticorpos utilizados aqui são direcionados contra a proteína vesicular de cadeia de cisteína e o anticorpo anti-HRP. O anti-HRP reconhece uma porção carboidrata neural específica presente nos glicoproteínas de superfície, que marca todos os neurônios.
Incube os embriões durante a noite a quatro graus Celsius na solução de anticorpo primário. Lave os embriões 10 vezes com PBT ao longo de uma hora. Aplicando aproximadamente um mililitro de PBT ao vial de vidro contendo os embriões, deixe os embriões em repouso por seis minutos antes de remover o PBT.
Repita este processo de aplicação de PBT, incubação e remoção de PBT dez vezes. Prepare a solução de anticorpo secundário no escuro, pois é sensível à luz, diluindo até a concentração apropriada. Utilizamos anticorpos secundários Alexa na concentração de um para 200.
Incube os embriões por duas horas a quatro graus Celsius na solução de anticorpo secundário. Envolva o frasco de vidro contendo os embriões e a solução de anticorpo secundário com folha de alumínio para evitar exposição à luz. Lave os embriões 10 vezes com PBT ao longo de uma hora.
Adicione meio de montagem com escudo vetorial aos embriões e incube-os durante a noite a quatro graus Celsius para montagem. Use uma pipeta pastel para aspirar os embriões junto com um pouco do meio de montagem. Aplique os embriões e o meio em uma lâmina de vidro.
Coloque uma lamínula sobre os embriões e selar a lamínula com esmalte. Visualize os embriões utilizando um microscópio de fluorescência aqui. O SNC embrionário é mostrado nas fases 16 a 17.
A proteína da cadeia de cistina é mostrada em vermelho. Os neurônios HRP são mostrados em verde. Observe a coloração distinta do comissura nesta imagem representativa.
O SNP embrionário é mostrado no estágio 16 a 17. Novamente, a proteína da cadeia da cistina é mostrada em vermelho, e os neurônios são mostrados em verde. Observe os padrões repetidos de neurônios periféricos.
Ao tentar este procedimento, é importante ter cuidado com os embriões para não removê-los acidentalmente do frasco. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar embriões oph fla para a visualização em montagem inteira do sistema nervoso.
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Visão Geral
Este artigo descreve um procedimento detalhado para preparar embriões de Drosophila em diferentes estágios com o objetivo de visualizar o sistema nervoso embrionário durante a embriogênese. O método envolve várias etapas, incluindo coleta de embriões, fixação e coloração com anticorpos, permitindo, em última instância, a observação de estruturas neuronais por meio de microscopia de imunofluorescência.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Embriologia
Contexto
- Compreender o sistema nervoso embrionário é fundamental para obter insights sobre os processos de desenvolvimento.
- A visualização de estruturas neuronais pode ajudar a elucidar os efeitos de mutações genéticas.
- A microscopia de imunofluorescência é uma técnica poderosa para o estudo de componentes celulares.
- A preparação adequada de embriões é essencial para resultados bem-sucedidos de imagem.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável para visualizar o sistema nervoso em embriões de Drosophila.
- Facilitar a pesquisa sobre o papel de mutações no desenvolvimento do sistema nervoso.
- Aprimorar a compreensão da estrutura neuronal embrionária por meio de técnicas avançadas de imagem.
Métodos Utilizados
- Coleta de embriões de linhagens específicas de Drosophila.
- Uso de hipoclorito e heptano para remoção da membrana e fixação.
- Aplicação de anticorpos primários e secundários para coloração específica.
- Visualização de embriões utilizando microscopia de fluorescência.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida do sistema nervoso embrionário no estágio 16.
- Demonstração da eficácia do protocolo de coloração com anticorpos.
- Compreensão da organização estrutural dos neurônios em embriões em desenvolvimento.
- Identificação de desafios potenciais para novos pesquisadores no protocolo.
Conclusões
- O protocolo descrito fornece um método abrangente para o estudo do sistema nervoso embrionário de Drosophila.
- A microscopia de imunofluorescência é validada como uma ferramenta eficaz para esta pesquisa.
- Estudos futuros podem aproveitar este método para explorar as influências genéticas no desenvolvimento do sistema nervoso.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A visualização do sistema nervoso embrionário em embriões inteiros de Drosophila permite a investigação de alta resolução do desenvolvimento neuronal e das perturbações genéticas. Este fluxo de trabalho apoia a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas ao fornecer visualização direta da arquitetura neuronal e das consequências fenotípicas de mutações. A abordagem está estrategicamente posicionada para triagem de portfólios e para aumentar a confiança preditiva em pipelines de pesquisa em neurodesenvolvimento.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a avaliação direta de fenótipos neuronais em resposta a modificações genéticas.
- Apoia a validação funcional de alvos neurodesenvolvimentais por meio de visualização baseada em anticorpos.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao revelar padrões anômalos do sistema nervoso com resolução em nível de única célula.
- Oferece uma plataforma robusta para investigação orientada por hipóteses das vias de desenvolvimento.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece um sistema reproduzível para a visualização quantitativa de estruturas neuronais.
- Padroniza a detecção baseada em anticorpos para triagem posterior de perturbações genéticas ou químicas.
- Permite o preparo escalonável de embriões para fluxos de trabalho de imagem de alto conteúdo.
- Fornece saídas quantitativas adequadas para análise comparativa entre condições experimentais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a modelos relevantes para doenças ao permitir a visualização de defeitos neurodesenvolvimentais.
- Apoia a continuidade desde a descoberta genética até a validação pré-clínica em neurobiologia.
- Fornece desfechos fenotípicos para o avanço ajustado ao risco de compostos neuroativos.
- Amplia o valor preditivo para a identificação de biomarcadores translacionais em neurociência do desenvolvimento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a verificação inicial de hipóteses genéticas até a identificação de compostos líderes e a validação de modelos pré-clínicos na pesquisa de neurodesenvolvimento.
- Biologia da Descoberta: Apoia o teste de hipóteses nulas ao permitir a visualização de alterações nos padrões neuronais após manipulação genética.
- Triagem: Fornece saídas de imagem padronizadas e reprodutíveis para triagem comparativa de efeitos fenotípicos.
- Análises: Oferece leituras quantitativas baseadas em anticorpos para análise estatística robusta do desenvolvimento neuronal.
- Pesquisa Translacional: Conecta as fases de descoberta e pré-clínica ao alinhar saídas fenotípicas com desfechos relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável para diversos estudos de neurodesenvolvimento em múltiplos contextos genéticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos neurodesenvolvimentais.
- Valor Operacional: Oferece fluxos de trabalho padronizados, escalonáveis e reprodutíveis para visualização neuronal baseada em anticorpos.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao fornecer clareza fenotípica precoce.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e compostos neurodesenvolvimentais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manejo de Drosophila e na microscopia de imunofluorescência.
- Exige acesso à infraestrutura de imagem de fluorescência e a reagentes de anticorpos validados.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes nos protocolos de estadiamento de embriões e coloração.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes origens genéticas ou estágios de desenvolvimento.
- O manuseio cuidadoso dos embriões é essencial para evitar perda de amostras e garantir reprodutibilidade.
