Visualização do Sistema Nervoso embrionárias no Whole-mount Drosophila Os embriões

O objetivo geral deste procedimento é preparar embriões oph e melanogaster para visualização completa do sistema nervoso. Isso é feito coletando primeiro embriões da linhagem de mosca de interesse. A segunda etapa do procedimento é remover o cório com alvejante.

A terceira etapa do procedimento é aplicar heptano e metanol para remover a membrana da vilina. A etapa final do procedimento é aplicar anticorpos aos embriões. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a estrutura do sistema nervoso do embrião de drosófila por meio de microscopia de imunofluorescência.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como o papel que as mutações podem desempenhar no sistema nervoso em desenvolvimento. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque podem acidentalmente retirar embriões do frasco. Comece este protocolo preparando os reagentes que serão necessários, incluindo P-E-M-F-A, tampão PBC 5%BSA com solução salina de azida de sódio a 0,01% e fixador de formaldeído.

Prepare uma gaiola para a cepa de drosófila de interesse, derrubando as moscas com dióxido de carbono e, em seguida, transferindo pelo menos 100 moscas para uma garrafa de plástico contendo um adaptador com uma placa de alimentação de ágar suco de maçã. Coloque a gaiola de moscas no escuro em temperatura ambiente por 72 horas. Troque as placas de alimentação de ágar suco de maçã a cada oito a 12 horas para que as moscas se aclimatem à gaiola e não segurem seus ovos para o experimento.

Após o período de aclimatação de 72 horas, colete os embriões 12 horas após a última troca na placa de alimentação de ágar suco de maçã. Remova a placa de alimentação de ágar suco de maçã da gaiola de postura e substitua-a com solução salina. Lave a placa de alimentação de ágar suco de maçã.

Colete os embriões em uma peneira fina. Use um pincel limpo para desalojar quaisquer embriões que permaneçam presos à placa. Lave os embriões na peneira com soro fisiológico para remover o excesso de fermento usando uma espátula, pegue suavemente os embriões e coloque-os em um pequeno frasco de vidro.

Adicione cerca de um mililitro de solução salina. Em seguida, tampe o frasco e incube por cinco minutos para lavar os embriões. Após a coleta de embriões.

Prepare a solução fixa de heptano combinando 50% de heptano e 50% de fixador. A solução será revestida com heptano na parte superior e o fixador na parte inferior. Após cinco minutos, use uma pipeta de macarrão para remover o excesso de solução salina do frasco de vidro dos embriões.

Enxágue os embriões com água deionizada aplicando aproximadamente um mililitro de água deionizada no frasco de vidro contendo os embriões. Deixe os embriões descansarem por um minuto antes de remover a água em uma solução de alvejante a 50%. Agitar o frasco algumas vezes com a mão e depois incubar durante três minutos para revestir os embriões.

Os embriões aduzidos afundarão no fundo do frasco. Os CORs embrionários flutuarão. Remova o alvejante e os CORs após os três minutos de incubação.

Após a decoração, enxágue bem os embriões com água deionizada aplicando aproximadamente um mililitro de água deionizada no frasco de vidro contendo os embriões. Deixe os embriões descansarem por um minuto antes de remover a água que os CORs restantes flutuarão e devem ser removidos. Adicione a solução de correção de heptano aos embriões e incube-os por 30 minutos com agitação suave para fixá-los após a fixação.

Use uma pipeta de macarrão para remover o fixador, que é a camada inferior, deixando o heptano no tubo. Em seguida, adicione o metanol de volta ao fundo do tubo no lugar do fixador e tampe o tubo, agite vigorosamente com a mão para remover a membrana vitelina. Após esta etapa, os embriões abaixados no fundo do tubo.

Usando uma pipeta de macarrão, remova o metanol e os hets do frasco deixando para trás os embriões deionizados. Em seguida, enxágue os embriões cinco vezes com metanol, removendo o metanol com uma pipeta de macarrão entre cada enxágue. Para cada enxágue, incube os embriões por cinco minutos.

Coloque os embriões em uma mistura de solução de 50% de PBT e 50% de metanol por cinco minutos para reidratá-los. Em seguida, continue o processo de reidratação transferindo-os para a solução de PBT a 100% por cinco minutos. Em seguida, bloqueie os embriões incubando-os em 5% BSA com solução de azida de sódio a 0,01% por uma hora a quatro graus Celsius.

Em seguida, prepare o anticorpo primário para coloração embrionária, diluindo-o até a concentração apropriada usando 5% BSA com solução de azida de sódio a 0,01%. Os anticorpos usados aqui são direcionados contra a proteína da corda de cisteína vesicular e o anticorpo anti-HRP. O Anti HRP reconhece uma porção neural específica de carboidratos presente nas glicoproteínas de superfície, que rotula todos os neurônios.

Incube os embriões durante a noite a quatro graus Celsius na solução primária de anticorpos. Lave os embriões 10 vezes com PBT ao longo de uma hora. Aplicando aproximadamente um mililitro de PBT no frasco de vidro que contém os embriões, deixe os embriões descansarem por seis minutos antes de remover o PBT.

Repita este processo de aplicação de PBT, incubando e removendo PBT 10 vezes. Preparar a solução de anticorpos secundários no escuro, uma vez que é sensível à luz, diluindo-a até à concentração adequada. Usamos anticorpos secundários Alexa em uma concentração de um a 200.

Incubar os embriões por duas horas a quatro graus Celsius na solução de anticorpos secundários. Embrulhe o frasco de vidro dos embriões e da solução de anticorpos secundários em papel alumínio para evitar a exposição à luz. Lave os embriões 10 vezes com PBT ao longo de uma hora.

Adicione o meio de montagem do escudo vetorial aos embriões e incube-os durante a noite a quatro graus Celsius para montar. Use uma pipeta pastel para sugar os embriões junto com parte do meio de montagem. Aplique os embriões e o meio em uma lâmina de vidro.

Aplique uma lamínula sobre os embriões e sele a lamínula com esmalte. Visualize embriões usando um microscópio de fluorescência aqui. O SNC embrionário é mostrado nos estágios 16 a 17.

A proteína da corda de cistina é mostrada em vermelho. Os neurônios HRP são mostrados em verde. Observe a coloração distinta da comissura nesta imagem representativa.

O SNP embrionário é mostrado nos estágios 16 a 17. Novamente, a proteína da corda de cistina é mostrada em vermelho e os neurônios são mostrados em verde. Observe os padrões repetidos de neurônios periféricos.

Ao tentar este procedimento, é importante estar atento aos embriões para não removê-los acidentalmente do frasco. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar embriões oph fla para visualização de montagem inteira do sistema nervoso.