Geração de RNA / DNA híbrido em DNA genômico por transformação por meio de RNA contendo Oligonucleotídeos

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar híbridos de R-N-A-D-N-A ao nível cromossômico em células de levedura vivas, transformando as células de levedura com oligos contendo R-N-A. Isso é alcançado pela introdução de um oligo de fita simples contendo R-N-A nas células de levedura em divisão. Em seguida, o oligo hibridiza com a região complementar de um gene marcador mutado localizado em um cromossomo de levedura, formando um híbrido de R-N-A-D-N-A. Como segundo passo, as células transformadas pelo oligo contendo R-N-A são semeadas em meio seletivo.

Isso permite o crescimento de células nas quais a porção de RNA do oligo serve como molde para a correção do gene marcador mutado. Em seguida, as colônias de levedura que crescem em meios seletivos são contabilizadas para determinar a frequência de correção gênica pelo oligo contendo RNA, obtendo-se resultados que revelam a transferência de informação genética do trecho de RNA do oligo para o gene marcador mutado no genoma da levedura. Isso é evidente a partir da análise por digestão com enzimas de restrição, análise de sequência e ensaio de instabilidade alcalina.

Olá, sou o HIN founder, do laboratório da Dra. Francesca na escola de biologia do Instituto de Tecnologia da Geórgia. Hoje vamos mostrar um procedimento para gerar híbridos R-N-A-D-N-A no nível cromossômico em células vivas de levedura. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar como a presença de RNA incorporado no DNA genômico é tolerada pelas células e para determinar quais fatores afetam a estabilidade dos híbridos R-N-A-D-N-A in vivo.

Então vamos começar. Antes do início deste procedimento, limpe todos os materiais que serão utilizados no experimento, incluindo tubos de oligo, pipetas, suportes para vórtex, área experimental e luvas usadas pelo pesquisador com solução de descontaminação de RNAses. Para remover qualquer contaminação potencial por RNAses, utilize água livre de RNAses, reagentes químicos, tubos e ponteiras de pipeta livres de RNAses durante todo o procedimento.

Obtenha um oligonucleotídeo contendo RNA para transferir informações genéticas para o DNA genômico de células de levedura. A linhagem de levedura utilizada aqui contém um gene trip five mutante com uma deleção de duas bases e uma mutação sem sentido. Essa linhagem de levedura é um mutante atrófico de triptofano e não forma colônias em meio sem triptofano.

O oligo contendo RNA é um 65 MER com uma inserção de dois pares de bases de DNA projetada para corrigir a mutação por deleção. Além disso, o oligo possui um ribonucleotídeo para corrigir a mutação sem sentido do alelo trip cinco. Uma vez obtido, prepare o oligo contendo RNA em uma solução estoque de 250 micromolar conforme descrito no protocolo escrito. 16 horas antes da transformação com o oligo contendo RNA, inocular.

Cinco mililitros de meio líquido rico em extrato de levedura, peptona e dextrose, ou meio YPD líquido, com as células mutantes de levedura trip five, e cultivar as células a 30 graus Celsius durante a noite. Após a incubação noturna, transferir 1,5 mililitro da cultura noturna para 50 mililitros de meio YPD líquido. Incubar as células em agitador a 30 graus Celsius a 225 rotações por minuto durante quatro horas imediatamente antes da transformação por descongelamento.

Os oligos contendo RNA e os oligos correspondentes apenas de DNA mantidos no gelo. Os oligos correspondentes apenas de DNA são utilizados como controle positivo. Dilua os oligos até 50 micromolar com água livre de RNAs em tubos livres de RNAs.

Prepare 70 microlitros de cada oligo para obter quantidade suficiente de amostra para três transformações de um mol, com um pequeno excesso; desnature os oligos contendo RNA e os oligos somente de DNA no bloco de aquecimento a 100 graus Celsius por dois minutos para eliminar as estruturas secundárias dos oligos imediatamente após a desnaturação. Coloque os tubos no gelo, mantendo-os ali até a transformação. Prepare a solução um e a solução dois imediatamente antes da transformação em tubos livres de RNAs. Transfira a cultura celular para um tubo de 50 mililitros livre de RNAs e centrifugue a 3000 rotações por minuto, correspondendo a 1.562 vezes a gravidade, por dois minutos.

Remova o sobrenadante e lave as células com 50 mililitros de água livre de RNAses. Centrifugue as células novamente a 3000 rotações por minuto durante dois minutos. Repita este processo cinco vezes para eliminar o meio de cultura e quaisquer RNAses que possam estar presentes após a centrifugação final.

Remova o sobrenadante e re-suspenda as células em cinco mililitros da solução um. Centrifugue a amostra a 3000 rotações por minuto durante dois minutos, descarte o sobrenadante e adicione 250 microlitros da solução um às células. Esta quantidade de células é suficiente para sete a oito transformações.

Aliquotar 50 microlitros da suspensão celular em cada um dos sete tubos microcentrífuga livres de RNAses. Em seguida, adicionar 20 dos oligos contendo RNA de 50 micromolar em três tubos, 20 microlitros do oligo de DNA apenas de 50 micromolar em três tubos e 20 microlitros de água estéril sem oligo para o controle negativo em um tubo.

Em seguida, adicione 300 microlitros da solução dois para cada uma das sete reações de transformação. Agite as amostras vigorosamente em vórtex para misturar os componentes. Incube as reações de transformação a 30 graus Celsius por 30 minutos em um agitador após a incubação.

Submeta as amostras a choque térmico a 42 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, centrifugue as células a 5.000 rotações por minuto, correspondendo a 2.236 ×g, por quatro minutos. Remova o agente SUP e ressuspenda as células em 100 microlitros de água estéril em várias das três tubos.

Retire uma alíquota dessa suspensão celular e dilua cada alíquota com água estéril em 100.000 vezes. Adicione cerca de 15 esferas de vidro estéreis por placa e plaque 100 microlitros das células diluídas em 100.000 vezes em três placas de YPD. Plaque 100 microlitros das células re-suspensas de cada reação de transformação em uma placa de ágar meio sintético completo sem triptofano e agite as placas uniformemente.

Em seguida, remova as microesferas. Incube as células em placas de YPD a 30 graus Celsius por dois dias e incube as células emplacadas em meio sólido completo sintético sem triptofano a 30 graus Celsius por quatro a cinco dias. Conte e compare o número de colônias desenvolvidas no meio seletivo, bem como no meio YPD, para calcular a frequência de correção gênica para o oligo contendo RNA, para o oligo de DNA apenas e para o controle sem oligo.

Espera-se que nenhuma formação de colônia ocorra no meio seletivo quando nenhum oligonucleotídeo for adicionado às células; estriar várias colônias transformadas escolhidas aleatoriamente em meio YPD para obter isolados de colônias individuais. Incubar as células por dois dias a 30 graus Celsius para crescimento das colônias. Após a incubação, escolher várias colônias individuais e fazer manchas em meio YPD e no meio seletivo.

Após um dia de incubação, é observado crescimento em meio sólido sintético completo sem triptofano para as células transformadas com os oligonucleotídeos, mas não para a cepa controle sem oligonucleotídeo no meio sólido sintético completo seletivo sem triptofano. Em seguida, projete um par de iniciadores para amplificar a região alvo do oligonucleotídeo contendo RNA utilizando PCR de colônia para iniciar a PCR de colônia. Re-suspenda as células provenientes dos fragmentos individuais em 50 microlitros de água contendo uma unidade de liase; incube as amostras à temperatura ambiente por 10 minutos, seguido por incubação em bloco térmico a 100 graus Celsius por cinco minutos para romper as células e liberar o DNA genômico na solução.

Prepare as reações de PCR em tubos de PCR, adicionando 10 microlitros da suspensão celular a cada tubo e realize a reação de amplificação conforme descrito no protocolo escrito. Execute as amostras resultantes em um gel de agarose 1% para observar o produto de PCR. Como a informação genética transferida pelo oligo contendo RNA neste experimento gera um novo sítio de restrição VAN 91 1 na região genômica alvo da levedura, é possível verificar a transferência correta da informação digerindo o produto de PCR com a enzima de restrição van 91 1.

Prepare a reação de digestão contendo seis microlitros do produto da PCR, tampão BSA e 0,5 microlitros da enzima de restrição, completando o volume com água estéril até 15 microlitros. Incube as amostras por uma hora a 37 graus Celsius. Execute uma amostra não digerida juntamente com as amostras digeridas na mesma linha de um gel de agarose 2% para observar a modificação genética transferida pelo trecho de RNA do oligo contendo RNA.

Purifique os produtos de PCR utilizando um kit de purificação de PCR e prepare-os para o sequenciamento de DNA. Envie as amostras para sequenciamento com os mesmos iniciadores utilizados para amplificar o produto. Por fim, analise os resultados do sequenciamento de DNA usando um software que permita o alinhamento de múltiplas sequências com uma sequência de referência escolhida para realizar o tratamento alcalino do oligo contendo RNA para cada reação com um mol do oligo contendo RNA ou do oligo somente de DNA em um tubo de 1,5 mililitro.

Em seguida, adicione quatro microlitros de hidróxido de sódio um molar para a hidrólise ou quatro microlitros de água para o controle negativo. Incube as amostras a 65 graus Celsius em banho-maria por uma hora após a incubação. Transfira a reação para gelo.

Neutralize a reação de hidrólise com dois microlitros de ácido clorídrico 1,2 molar, quatro microlitros de tris hidrocloreto 1 molar e quatro microlitros de água para o controle negativo. Adicione seis microlitros de água e quatro microlitros de tris hidrocloreto 1 molar. Mantenha as amostras em gelo até que a transformação possa ser realizada.

Como acabou de ser descrito, células de levedura transformadas sem oligo não formam nenhuma colônia em meio sólido completo sintético sem triptofano fan. Por outro lado, células cultivadas em meio sólido completo sintético sem triptofano após transformação com um oligo de RNA contendo oligo agora mostram colônias.

Colônias de levedura também crescem em meio sólido sintético completo sem triptofano após as células serem transformadas com um nanomol do oligonucleotídeo controle correspondente; a detecção da transferência de informação genética do oligonucleotídeo contendo RNA para o DNA cromossômico da levedura é evidente pela digestão com a enzima de restrição VAN 91 1 do produto de PCR que amplifica a região genômica alvo, conforme mostrado; o produto de PCR do locus trip. Five amplificado do DNA genômico da linhagem mutante trip. Five pode ser observado.

Também é mostrado o produto de PCR amplificado a partir de DNA genômico derivado de uma colônia triplo positiva (trip plus) direcionada pelo oligo somente de DNA. Os produtos de PCR amplificados a partir de DNA genômico derivado de colônias triplo positivas (trip plus) direcionadas pelo oligo contendo RNA também foram submetidos à eletroforese em gel. Os resultados da digestão com a enzima de restrição van 91 1 dos mesmos produtos de PCR revelam uma banda amplificada de 278 pares de bases e as bandas dos produtos de digestão por van 91 1 de 177 pares de bases e 101 pares de bases.

O sequenciamento de DNA revela a correção gênica pelo oligonucleotídeo contendo RNA aqui. É mostrado um eletroferograma de DNA da região genômica direcionada pelo oligonucleotídeo contendo RNA. O g na sequência de DNA deriva do RG no oligonucleotídeo contendo RNA.

Também destacado em caixa está a inserção das sequências da base CG da região trip cinco dos transformantes trip mais, direcionados pelo oligo somente de DNA e pelo oligo contendo RNA, que coincidem na sequência consenso e são comparados com o da trip. Células mutantes cinco antes do direcionamento pelos oligos. O oligo inferior contendo RNA de reparo possui uma inserção de dois pares de bases de DNA e uma substituição de uma base de RNA.

A região delimitada em azul com sombreamento amarelo mostra que o oligo contendo RNA, bem como o oligo somente de DNA, corrigiram com precisão a mutação por deleção e a mutação sem sentido em todas as amostras testadas; as linhas tracejadas marcam a posição da sequência do oligo contendo RNA. O tratamento alcalino impede a correção gênica pelo oligo contendo RNA; a frequência de transformação pelo oligo contendo RNA e pelo oligo somente de DNA é apresentada. As barras de erro representam o erro padrão da média de três transformações independentes para cada oligo.

O oligo somente com DNA exibe frequência de transformação semelhante na ausência e na presença de tratamento com hidróxido de sódio. Por outro lado, a frequência de transformação pelo oligo contendo RNA cai a zero após o tratamento com hidróxido de sódio. Portanto, a preparação com o oligo contendo RNA não está contaminada com o oligo somente com DNA.

Assim, a frequência de transformação observada é específica para o oligonucleotídeo contendo RNA. Acabamos de mostrar como formar um híbrido R-N-A-D-N-A ao nível cromossômico e a transferência reversa de informação genética de RNA para DNA genômico em células de levedura. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de utilizar oligonucleotídeos contendo RNA de excelente qualidade e de trabalhar em condições livres de RNA.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.