Name: Adenovírus mediada por remoção genética das moléculas de sinalização em fibroblastos de rato cultivadas Primária embrionárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprenda a usar adenovírus para entrega de Cre recombinase em fibroblastos embrionários de camundongo, permitindo excisão eficiente do alelo floxed Rac1. Este método viabiliza estudos detalhados sobre a função do Rac1 na dinâmica de actina.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Scott Rizaldy no Hospital Monte Sinai em Toronto, Ontário, pelo seu dom da principal Rac1 flox / flox fibroblastos embrionárias de camundongos. Este trabalho foi financiado por subvenções de funcionamento a NJ do Canadian Institutes of Health Research (CIHR, MOP 2009-93526) e de Ciência Natural e Pesquisa de Engenharia Council of Canada (NSERC, RG 327372-06). SH e MW são suportados pelo CGSMA e CGS M-prêmios de CIHR e NSERC, respectivamente. Wills Steve Hawley e Melanie contribuíram igualmente para este papel.

Células descongelamento <ol><li> Obtenção de fibroblastos de rato congelado embrionárias (MEFs) (gerado anteriormente a partir de culturas primárias individuais de embriões) de nitrogênio líquido. </li><li> Células descongelar por imersão frasco em 37 ° C de água com movimentos circulares até conteúdo esteja completamente descongelado. </li><li> Adicionar 9ml de DMEM que foi suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina a uma placa de cultura de células 10 centímetros. </li><li> Adicione a suspensão de células descongeladas gota a gota, à placa, rock a placa suavemente para dispersar as células e colocar a placa em 37 ° CO C, 5% 2 incubadora durante a noite. Note-se que se as células são sensíveis à DMSO (a partir do processo de congelamento), meios de comunicação inicial pode ser substituído com a mídia fresco depois que as células tenham aderido à placa (aproximadamente quatro horas após a plating). Observe também que confluência das células após o descongelamento depende do número de células congeladas, a taxa de recuperação das células após o congelamento, ea taxa de crescimento das células. </li></ol> Células Passaging <ol start="5"><li> Quando as células têm crescido a confluência essencialmente 100% (ou seja: no dia seguinte), aspirar a mídia off e lavar as células com 5mL de PBS estéril. </li><li> Remover PBS e adicionar 1 ml de tripsina contendo 10mM EDTA e colocar a placa na incubadora por aproximadamente 5 minutos para permitir que as células de separar da placa. </li><li> Quando as células têm destacado, adicione 9ml de mídia para as células tripsinizados, pipeta 2-3 vezes para dispersar aglomerações, adicione 1 mL desta suspensão gota a gota, em um prato novo contendo 9ml de mídia, e colocar isso para a 37 ° C durante a noite incubadora . A presença de FBS na mídia vai inativar a tripsina, alternativamente, as células podem ser lavadas primeiro a diluir a tripsina. </li></ol> Contagem e cultivo de células em lamínulas <ol start="8"><li> Remover as células da incubadora, lavar e trypsinize como antes, só que desta vez adicionar 5-6ml de volta para o tripsinizados células em vez de 9ml. </li><li> Células pipeta cuidadosamente para garantir total dissociação em uma suspensão de células individuais, e remover 15μL para combinar com 15μL de azul de tripano em um tubo de microcentrífuga separado. </li><li> Misturar esta suspensão celular / azul de tripano pipetando cima e para baixo várias vezes, e adicionar 15μL para o hemocitômetro. </li><li> Sob o microscópio, as células mortas aparecerá azul. Contar o número de células claras / incolor (vivendo) em uma das grades 4X4 sobre o hemocitômetro. Repita este contar com as três outras grades 4X4 (A denotado, B, C e D) e use a seguinte equação para calcular o número de células por mL de suspensão: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="Equação 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 1"></li><li> Através da otimização de protocolo, nós determinamos que chapeamento de 30.000 células resulta na densidade de células adequadas para visualização na conclusão do experimento. </li><li> Para calcular o volume de suspensão de células necessárias para 30.000 células, use a seguinte equação: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="Equação 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 2"></li><li> Agora coloque uma lamínula estéril de vidro em cada poço de uma placa de seis bem e adicione 2 ml de mídia para cada poço, e depois adicionar gota a gota, a partir de sua suspensão celular o volume necessário para 30.000 células em cada poço. Note-se que lamínulas de vidro são usados ​​para este experimento, já que estaremos visualizando as células usando microscopia de fluorescência em um ponto mais tarde, nem todos os aplicativos serão necessariamente microscopia, e, assim, cobrir deslizes não podem ser exigidos. </li></ol> Transdução de vírus <ol start="15"><li> Depois de várias horas ou durante a noite (tempo suficiente para assegurar que as células aderem à lamínulas), remova a mídia e lavar as células com 1 ml de soro livre de DMEM. </li><li> Adicione 1 ml de soro livre de media a cada poço para a adição do vírus. Para este experimento, vírus adeno-Cre foi obtido comercialmente a partir de Biolabs Vector. </li><li> Otimização de protocolo anterior mostrou que uma multiplicidade de infecção (MOI) de 500 fornece transdução de genes altamente eficiente em MEFs primária com pouco ou nenhum efeito na viabilidade celular. MOI pode ser calculado como segue: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="Equação 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 3"> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="Equação 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 4"></li><li> Adicionar o volume calculado de vírus diretamente a cada poço que está a ser infectado, agite levemente o prato para dispersar as células de vírus e colocar na incubadora a 37 ° C durante a noite. </li><li> Na manhã seguinte, remova o vírus contendo mídia a partir de células e lavar as células em 1mL de PBS estéril e em seguida, adicione 2 mL de meios regulares a cada poço. </li><li> No caso do Rac1 células exemplificado neste experimento, ocorreram alterações morfológicas nas células em aproximadamente 72 horas de transdução de post. </li></ol> Resultados representante Células foram visualized através da coloração com o corante de actina phalloidin (para fins de imagem apenas) e fotografada usando a Leica TCS-SP5 multifotônica microscópio laser confocal no Centro de Análise Avançada da Universidade de Guelph. A Figura 1 mostra a morfologia contratados e alongado do Rac1 flox / flox células que foram expostos ao vírus adeno-Cre em comparação com as mesmas células não expostas ao vírus. <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Comparação entre Rac1 flox / flox células infectadas com o vírus adeno-Cre (esquerda) em comparação com células não infectadas pela mesma fonte (direita).

<ol><li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li>
<li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li>
<li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li>
<li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li>
<li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li>
<li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li>
</ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Canadian Council on Animal Care.

O vídeo que acompanha exemplifica como um vírus recombinante pode ser usada para um gene especial de consumo específico in vitro utilizando Cre recombinase. O desenvolvimento deste protocolo no entanto revelou alguns pontos em particular no valor de endereçamento. <ul><li> Procedimentos de segurança deve sempre ser empregada quando se trabalha com adenovírus. Um jaleco e luvas devem ser usadas todo tempo enquanto trabalhava com o vírus. Mídia e utensílios de plástico devem ser tratadas com lixívia a 10% por pelo menos 30 minutos, e utensílios de plástico devem ser autoclavados depois. </li><li> Evite repetidos de congelamento e descongelamento do estoque de vírus como este podem afetar a título de vírus e, assim, reduzir a eficiência de transdução. Pequenos volumes de estoque de vírus deve inicialmente ser aliquotado em tubos separados. </li><li> MOIS variando 5-50 foram testados durante o desenvolvimento do método e as taxas de transdução eficiente foram observados na maioria dos casos, sem efeitos negativos sobre a viabilidade celular. </li><li> Adeno-GFP foi usado também durante o desenvolvimento do método para rapidamente a eficiência de transdução de tela. Este controle (ou um vetor vazio) deve ser realizada durante o experimento para assegurar que a infecção viral por si só não resulta em alterações celulares. Da mesma forma, se excisão do gene floxed de interesse em suas células não resultar em qualquer alteração celular (ou seja, alterações na morfologia ou viabilidade), então infectar o mesmo tipo de célula com adeno-GFP é um controle importante usar para demonstrar que a transdução de vírus é ocorrendo. </li></ul> Além do exame da cascata de sinalização na cultura, a abordagem adeno-Cre também tem sido empregada in vivo para condicionalmente remover genes de animais experimentais 3,4, e para rotular populações específicas de células dentro de um organismo 6. O sistema de adenovírus também pode ser adaptado para introduzir genes que não Cre recombinase em células hospedeiras. Duas principais vantagens do uso deste vetor de entrega são os seus transdução e eficiência de entrega de genes, e falta de integração com o DNA do hospedeiro. No entanto, a geração de novos adenovírus recombinante pode ser trabalhoso. O protocolo aqui descrito, portanto, utiliza a força do sistema adenoviral explorando o anteriormente desenvolvido vírus adeno-Cre, e acoplamento que com o nosso floxed alelo de interesse, Rac1. Através deste knock out condicional experimento, temos confirmado que transdução usando o vírus adeno-Cre de MEFs carregando um alelo Rac1 floxed realmente causar excisão de Rac1 levando à mudanças na morfologia celular característica de Rac1 deficiente células 2,5.

<table><tbody><tr><td>Vírus Ad-CMV-Cre</td><td>Vector Biolabs</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>Meio DME de alta glicose 500mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td></td></tr><tr><td>FBS de origem canadense 500mL</td><td>VWR international</td><td>CAA15-701</td><td></td></tr><tr><td>Solução PEN-STREP 1X 100mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X faloidina</td><td>Invitrogen</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td></td></tr></tbody></table>

adenovírus mediada por remoção genética das moléculas de sinalização em fibroblastos de rato cultivadas primária embrionárias

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

A capacidade de remover componentes geneticamente específicos de diversas cascatas de sinalização celular tem sido uma ferramenta essencial na análise moderna de transdução de sinal. Um determinado método para alcançar essa supressão condicional é através da utilização do sistema Cre-loxP. Este método envolve flanqueiam o gene de interesse com sites loxP, que são sequências de reconhecimento específico para a proteína recombinase Cre. Exposição dos chamados floxed DNA (ladeada pelo site loxP) para este enzima resulta em um evento de recombinação Cre-mediada nos locais loxP, e excisão subseqüente do gene intervindo 3. Existem vários métodos diferentes para administrar Cre recombinase ao local de interesse. Neste vídeo, demonstramos a utilização de um adenovírus contendo o gene Cre recombinase para infectar fibroblastos de rato principal embrionárias (MEFs) obtidas de embriões que contém um alelo Rac1 floxed 1. Nossa justificativa para a seleção Rac1 MEFs para nossos experimentos é que claro alterações morfológicas podem ser vistos após a exclusão de Rac1, devido a alterações no citoesqueleto de actina 2,5. 72 horas após a transdução viral e expressão Cre, as células foram coradas com o corante phalloidin actina e fotografada por microscopia confocal de varredura a laser. Observou-se que MEFs que haviam sido expostos ao vírus adeno-Cre apareceu contratada e na morfologia alongada em comparação com células não infectadas, de acordo com relatórios anteriores 2,5. O método de adenovírus Cre entrega recombinase é vantajoso como o vírus adeno-Cre é facilmente disponível, e deleção do gene através de Cre em quase 100% das células pode ser alcançado com a infecção adenoviral otimizado.

Neste vídeo, usamos um adenovírus carregando o gene Cre recombinase para infectar fibroblastos de rato principal embrionárias carregando um alelo Rac1 floxed.

Adenovírus mediada por remoção genética das moléculas de sinalização em fibroblastos de rato cultivadas Primária embrionárias

A capacidade de remover geneticamente componentes específicos de diversas cascatas de sinalização celular tem sido uma ferramenta fundamental na transdução de sinal moderna...

A análise genética moderna depende fortemente de técnicas que facilitam a remoção direcionada de genes específicos de células, órgãos ou organismos inteiros. Esses experimentos de eliminação ajudam a revelar a função do gene no seu contexto celular. Os fenótipos moleculares, morfológicos e fisiológicos do organismo modificado fornecem pistas sobre o papel dos produtos gênicos codificados pela sequência deletada.Em organismos modelo, como camundongos, um método comum para obter uma deleção gênica condicional é delimitar o gene ou éxon de interesse com sítios loxP, que servem como sequências de reconhecimento para a enzima Cre Recombinase. A excisão irreversível do chamado alelo flanqueado é então catalisada pela Cre, eliminando assim a sequência do genoma. Existem diversos métodos diferentes para introduzir a Cre Recombinase no sistema, incluindo aqueles realizados in vivo e aqueles que atuam diretamente em células estabelecidas.Para esta aplicação específica, utilizaremos um adenovírus para entregar Cree a células de fibroblastos que foram isoladas e cultivadas a partir de um camundongo transgênico portador de um alelo flock. Este método resulta em uma eficiência de quase 100% na entrega do transgene. Quando o vírus é administrado às células, ele é internalizado dentro de uma vesícula endocítica e transportado até a membrana nuclear, onde seu DNA, incluindo o transgene de interesse, pode penetrar no núcleo através do complexo poroso.A maquinaria celular pode então transcrever o gene injetado e permitir que seus produtos proteicos atuem na célula. Neste caso, a enzima Cre Recombinase codificada pelo vírus remove o alelo flanqueado do genoma da célula hospedeira. Somos do Laboratório Jones na Universidade de Guelph em Guelph, Ontário, Canadá.No nosso laboratório, estamos interessados no conceito de transdução de sinal e no que acontece quando se removem componentes específicos de diversas cascatas de transdução de sinal. Hoje vamos analisar uma cascata relacionada à organização da actina. A transdução de sinal é realizada por uma série de componentes bioquímicos que transmitem informações e induzem alterações fenotípicas, como a reorganização da actina.Nossa proteína de interesse é a RAC1, uma pequena GTPase importante na mediação da dinâmica do actina, incluindo adesão celular, migração e morfologia. Nesta investigação, utilizaremos o sistema CRE LAX P para remover este gene e confirmar seu papel na célula. Anteriormente, células fibroblásticas de camundongos embrionários com um alelo *floxado* de *Rack1* foram isoladas 12 dias após a fertilização.Essas células foram então colocadas em nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo, e começaremos descongelando um único frasco dessas células, representando um embrião. Ao realizar experimentos de cultura celular, é importante manter um ambiente estéril. Isso envolve limpar as superfícies expostas de uma câmara de fluxo aprovada, bem como pulverizar todos os frascos de reagentes e equipamentos de laboratório que entram na câmara com etanol a 70%.Uma vez que a cabine de fluxo laminar tenha sido preparada, descongele as células imergindo o frasco em um béquer com água a 37 graus Celsius até que o conteúdo esteja líquido. Em seguida, esterilize o frasco com etanol 70% e então adicione a suspensão celular gota a gota em uma placa de 10 centímetros contendo nove mililitros de DMEM, meio de alta glicose suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina.Streptomycin, agite suavemente a placa para dispersar as células e coloque-a no incubador a 37 graus com 5% de CO2, lembrando-se de rotular a placa com as informações apropriadas. As células geralmente atingem 100% de confluência dentro de 24 horas. Nesse momento, podemos repicar as células para uma nova placa.Para fazer isso, comece aspirando o meio antigo. Adicione cinco mililitros de PBS estéril para lavar as células e, em seguida, remova também essa solução. Agora, adicione um mililitro de tripsina contendo EDTA 10 milimolar.Coloque a placa no incubador a 37 graus por aproximadamente cinco minutos para permitir que as células se soltem do substrato. Retorne à cabine de fluxo e adicione nove mililitros de meio de volta à placa tripsinizada, diluindo assim as células em uma proporção de um para dez; pipete o líquido para cima e para baixo várias vezes para romper os agregados celulares e, em seguida, remova um mililitro da suspensão e adicione-o gota a gota a nove mililitros de meio fresco em uma nova placa de 10 centímetros. Novamente, agite suavemente a placa para dispersar as células e coloque-a no incubador a 37 graus.Quando as células atingirem confluência, o próximo passo é semeá-las em lamínulas de vidro para que possam ser visualizadas por microscopia. Prepare as células utilizando a mesma técnica usada para o empacotamento, até a adição de trips nas células e seu posicionamento no incubador a 37 graus Celsius. Enquanto as células estiverem se destacando da placa, prepare uma placa de seis poços com lamínulas de vidro, utilizando uma lamínula autoclavada por poço.Uma vez que as células tenham se destacado da placa, adicione cinco a seis mililitros de meio de cultura de volta às células tripsinizadas. Na próxima etapa do experimento, serão realizadas contagens celulares para que um número apropriado de células possa ser semeado, garantindo uma infecção viral eficiente. Para contar as células, combine 15 microlitros da amostra com uma parte igual de azul de tripano, pipete para cima e para baixo para homogeneizar e adicione 15 microlitros dessa solução ao hemocitômetro.Células mortas aparecerão azuis. Com esta preparação, conte apenas as células vivas ou incolores na grade quatro por quatro para calcular o número de células por microlitro. Comece contando as células em quatro grades separadas, de A a D, e calcule a média. Em seguida, multiplique esse valor por dois para compensar a diluição no azul de tripano.Como a grade contém um décimo de microlitro, multiplique por 10 para expressar o valor como células por microlitro. Em seguida, determine o volume necessário dividindo o número desejado de células pela concentração celular calculada anteriormente. Adicione o volume calculado da suspensão celular gota a gota a cada poço do recipiente de seis poços.Deixe essas células no incubador a 37 graus durante a noite. No dia seguinte, o vírus será adicionado às células. O vírus da febre do córrego Den, obtido da Vector B Labs, foi alíquotado e armazenado a 80 graus negativos Celsius.Recupere este vírus e retorne à cabine de fluxo laminar. Remova a placa de seis poços do incubador e leve-a para a cabine. Aspire o meio e lave as células com um mililitro de DMEM sem soro.Agora, adicione um mililitro de meio sem soro a cada poço para a adição do vírus. Para a aplicação viral, utilizamos uma multiplicidade de infecção ou MOI de 500. A otimização do protocolo foi previamente realizada utilizando várias MOIs, e descobrimos que uma MOI de 500 proporciona taxas de infecção altamente eficientes, com pouco ou nenhum efeito na viabilidade celular.Para calcular a MOI, utilize a seguinte equação. Comece calculando o número de vírus necessário, o que pode ser feito multiplicando-se a MOI desejada, neste caso 500, pelo número de células por poço, ou seja, 30.000. Para determinar o volume do estoque de vírus que deve ser usado, multiplique o número de vírus por 1000 e divida esse valor pela concentração inicial do vírus. Neste caso, adicionaremos 1,5 microlitros do estoque de vírus a cada poço que for ser infectado.Balançe suavemente a placa para dispersar o vírus e coloque a placa no incubador a 37 graus durante a noite. Na manhã seguinte, remova o meio de vírus das células, lave com PBS e adicione dois mililitros de meio regular às células. Neste experimento, observamos que alterações fenotípicas ocorreram nas células em aproximadamente 72 horas.Células coradas utilizando o Acton din foram imagiadas usando o microscópio confocal a laser multiphoton Leica T-C-S-S-P cinco no Centro de Análise Avançada da Universidade de Guelph. Isso revelou alterações na morfologia entre células infectadas e não infectadas. Aquelas que não possuem RAC um aparecem alongadas e finas em comparação com as células largas e achatadas que não foram infectadas.Aqui demonstramos que o sistema de cresta ADOC é um método robusto para entrega eficiente de genes a células, indo além do estudo da transdução de sinal. No entanto, você também pode usar este método para interromper genes em animais experimentais ou talvez para rotular populações celulares específicas em um organismo. O sistema de adenovírus também pode ser usado para introduzir genes diferentes de Cree ao princípio.As vantagens do uso deste método de entrega incluem sua alta afinidade, eficiência e ausência de integração com o DNA da célula hospedeira. No entanto, a geração de adenovírus comuns pode ser trabalhosa. O protocolo descrito aqui, portanto, aproveita o potencial do sistema adenoviral utilizando o vírus ocre previamente desenvolvido com nosso RAC flockado um mes, por meio deste knockout condicional, demonstramos que.Assim, a morfologia é, de fato, parcialmente dependente da proteína GTPase RAC1. Em conclusão, nós, do Laboratório Jones, gostaríamos apenas de agradecer por assistir ao nosso vídeo e desejamos boa sorte em todas as suas pesquisas futuras.

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