Name: O método de cultura de embriões de roedores inteiro usando o Rotator do tipo Sistema de Cultura Garrafa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprenda a técnica de cultura de embriões inteiros de roedores usando o sistema rotativo de cultura em garrafa. Este método permite estudar processos de desenvolvimento em condições controladas ex vivo.

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Nós agradecemos o Sr. Hajime Ichijo conselhos para a gravação de vídeo e útil para editar o vídeo. Agradecemos também Drs.Yuji Tsunekawa e Kaichi Yoshizaki para assistente de tipo para gravação de vídeo. Este trabalho é apoiado por KAKENHI em B Jovem Cientista ea prioridade Ciência Cérebro Áreas-Molecular de MEXT do Japão. Agradecemos o apoio da Global COE Programa &quot;Centro de Investigação Básica e translacional para a Ciência do Cérebro Global&quot; a partir MEXT do Japão e de Pesquisa Núcleo de Ciência e Tecnologia Evolutiva (CREST) ​​de Ciência japonês e Corporação de Tecnologia de Ciência do Japão e Agência de Tecnologia (JST) .

1. Configurando o sistema WEC <ol><li> Conjunta de uma membrana M 0,22 filtro para o tubo de silicone de entrada no sistema um WEC). </li><li> Abrir a válvula de um cilindro de gás contendo O 2 (95%) e CO 2 (5%). Fluxo da mistura de gases no cilindro através da garrafa borbulhando contendo água esterilizada. </li><li> Ajustar o volume do fluxo de mistura gasosa a 50 cc. </li><li> Insira o tubo de silicone para deixar em uma garrafa de água e verificar o fluxo de mistura gasosa. </li><li> Girar o tambor com a velocidade de 20 rpm / min. </li></ol> 2. Preparação de meio de cultura <ol><li> Rat-degelo imediatamente centrifugado (IC) de soro em 37,0 ° C b). Adicionar D-glicose (2 mg / ml) em soro descongeladas em um copo ml autoclavado 100. Meio de cultura deve ser preparado no nível de cultura primária (por exemplo, usando um capuz). </li><li> Adicionar antibióticos antimicótico líquido (100x) para o soro com 1: 400 de diluição. </li><li> Vaporize isoflurano restantes (devido à anestesia de ratos durante a coleta de sangue) do soro por 20 minutos em temperatura ambiente (RT) c). </li><li> Esterilizar o meio de cultura usando um filtro de membrana 0,45 mM. </li><li> Despeje 3,0 ml do meio em cada frasco de cultura e selar a parte superior de cada frasco com uma ficha de silício, coberta com folha de alumínio (ver ref. 14) d). </li><li> Prepare três ou quatro pratos disposição de Petri contendo solução salina e de Tyrode). </li></ol> 3. Anestesia do rato e do isolamento do útero <ol><li> Anestesiar um rato timed-grávidas profundamente com anestésicos inalatórios ou parenteral. </li><li> Limpar a área abdominal do rato anestesiado grávida de etanol 70%. </li><li> Pick up a pele com uma pinça e exteriorizar a parede abdominal, cortando a pele com uma tesoura grande f). </li><li> Pick up da parede abdominal com um par de fórceps e fazer em forma de U grandes incisões longitudinal na parede abdominal com uma tesoura grande até o nível torácico g). </li><li> Arribar do intestino para o lado esquerdo com um par de fórceps e expor uma extremidade do útero ligado ao ovário. </li><li> Pegue o final do útero com uma pinça e corte a posição entre o útero e ovário com uma tesoura grande. </li><li> Tirar o útero de ratos fêmeas grávidas, cortando a gordura ao redor do útero até a outra extremidade do útero. </li><li> Transferência do útero para uma placa de Petri contendo solução salina de Tyrode. </li><li> Euthanize o rato por excesso de administração de anestésicos ou deslocamento cervical após a remoção do útero. </li></ol> 4. Remoção dos embriões do útero <ol><li> Brevemente lavar o útero em solução salina Tyrode e transferi-lo para a segunda placa de Petri com um par de pinças finas h). </li><li> Sob um microscópio binocular, pegar a parede uterina com um par de pinças finas e cortar a parede uterina no lado oposto ao mesométrio conectar-se com os vasos sanguíneos usando uma tesoura oftálmica em linha reta. </li><li> Insira a ponta de uma tesoura oftálmica em linha reta no espaço entre a parede uterina e decídua. Cortar a parede uterina longitudinalmente ao longo do lado antimesometrial. </li><li> Moita a decidua no lado mesometrial e conceptos separado do útero através de dois pares de pinças finas i). </li><li> Transferência de conceptos à placa de Petri terceiro com uma pipeta de vidro esterilizados, com um diâmetro adequado. </li></ol> 5. Dissecação de embriões de ratos <ol><li> Inserir uma ponta do micropinças na decídua e fazer uma incisão transversal na decídua em torno do concepto com dois pares de fórceps. </li><li> Inserir as pontas dos pinça na decídua no lado placentário e fazer duas incisões longitudinais na decídua até o topo. </li><li> Remova a decídua no lado placentário rasgando que com dois pares de fórceps. Remover o decidua restantes com dois pares de fórceps. </li><li> Pick up membrana de Reichert, faça uma incisão horizontal sobre o mesmo, e separar a membrana do concepto no lado anti-placentária. </li><li> Faça um pequeno furo no saco vitelino perto da cabeça do embrião com os dois pares de fórceps, e cortar o saco vitelino com uma tesoura oftálmica curvas. É importante para não danificar os vasos sanguíneos. </li><li> Pegue o âmnio no local em torno da cabeça do embrião com os dois pares de pinças finas, e retire com cuidado o embrião a partir do saco vitelino, rasgando o âmnio h). O corpo do embrião deve ser puxado para fora do saco vitelino para aumentar a oferta de oxigênio para o embrião no estágio midgestation. </li></ol> 6. Cultura de embriões todo <ol><li> Verificar danos na placenta, saco vitelino, e da condição do coração batendo e circulação sanguínea. </li><li> Estar ciente de não esticar o cordão umbilical, a transferênciao embrião de um frasco de cultura com uma pipeta de vidro esterilizado. Reporte de solução salina Tyrode para garrafas de cultura deve ser o mínimo possível. </li><li> Remover um plug de silicone não-buraco do tambor rotador. Conectar o frasco de cultura com uma ficha com um buraco no tambor rotator do sistema WEC perpendicularmente. Tenha cuidado para não colocar força no tambor em direções inadequadas desde o drum rotador é um equipamento muito bem. Os frascos contendo o embrião dissecados são transferidos para a cultura, um por um; abertura da porta da frente da incubadora devem ser minimizados para evitar que a temperatura da incubadora é diminuída j). </li><li> Após 10 h de cultura, aumentar o volume de fluxo da mistura de gás de até 75 cc e até 100 cc após 24 h (Tabela 1). </li><li> O meio de cultura deve ser mudado em torno de 24 horas através da transferência dos embriões cultivados em uma garrafa nova cultura com o meio recém preparado. Aumentar o volume de fluxo de até 125 cc, depois de 34 horas e até 150 cc após 48 h (Tabela 1) </li><li> Ocasionalmente verificar a condição dos embriões cultivados contando taxa de batimentos cardíacos (ie, 120-150/min é ótima) e observando a circulação sanguínea. Se necessário contar o número de somitos para julgar o crescimento de embriões em solução salina de Tyrode. No desenvolvimento normal, um somito é adicionado em duas horas. </li><li> WEC quando estiver terminada, pare de alimentação de mistura de gás e desconectar o tubo de entrada eo filtro de membrana para evitar o refluxo para dentro do tubo de entrada da garrafa borbulhando. </li></ol> 7. Notas <ol class="lalpha"><li> A temperatura dentro do sistema WEC é constantemente mantido a 37,0-37,5 ° C. </li><li> 100% rat IC soro é utilizado rotineiramente em nosso WEC de embriões de rato e do rato, e mantidos a -20 ° C antes do uso. </li><li> Nós compramos rato IC soro, que é coletado de ratos que estão anestesiados com isoflurano. </li><li> Garrafas descartáveis ​​também estão disponíveis a partir de Ikemoto Rika. Garrafas e plugs de silicone devem ser autoclavados. </li><li> Dissecação de embriões devem ser realizados à temperatura ambiente porque a manutenção de embriões em temperatura baixa ou alta durante a dissecção afetam o desenvolvimento posterior no WEC. </li><li> Ferramentas para dissecção são esterilizados por calor seco. </li><li> A pele e parede abdominal devem ser cortados separadamente para evitar a contaminação dos cabelos em um prato possível. Mudamos um par de tesouras e pinças grandes com um novo par deles quando cortamos a pele e isolar o útero, respectivamente. </li><li> Utilizando uma pinça, cujas pontas são muito bem é muito importante para dissecar tecidos com certeza. Nós manualmente afiar as pontas de uma pinça com uma pedra e óleo de máquina. </li><li> Usamos um lado da pinça como uma faca para evitar excesso de pressão de embriões. </li><li> Quando a temperatura dentro do sistema WEC diminui, abrindo a porta repetidamente, continuamos a acender a luz para manter a temperatura dentro do sistema. </li></ol> 8. Resultados representativos A Figura 1 mostra os procedimentos de dissecação do embrião de rato e embriões de ratos cultivadas. <img src="/files/ftp_upload/2170/2170fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Cultura de embriões Whole do embrião de rato E12.5. (A) A concepto dissecados do útero de ratos fêmeas grávidas. (B) Remoção da decídua no lado placenta. (C) remoção da membrana de Reichert. (D) Abertura do saco vitelino. (E) O cultivo de embriões de rato na garrafa durante 6 horas após o início do WEC. (F) O embrião de rato cultivadas por 42 hr. d, decidua; R; membrana de Reichert; p, placenta; ys, saco vitelino, e, embrião. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 0 hr </td><td> 12 hr </td><td> 24 hr </td><td> 36 hr </td><td> 48 horas </td></tr><tr><td> E12.5 embrião de rato </td><td> 95% 50 cc </td><td> 95% 75 cc (10 h) </td><td> 95% 100 cc </td><td> 95% 125 cc (34 hr) </td><td> 95% a 150 cc </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Condições de oxigênio Optimal.

<ol><li>New, D. A. T. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNew%2C+DAT+%22In+Mammalian+Postimplantation+Embryos+A+Practical+Approach%22">In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach</a>. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 1-14 (1990).</li>
<li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22In+Mammalian+Postimplantation+Embryos+A+Practical+Approach%22%5BJournal%5D)">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 15-40 (1990).</li>
<li>Morris-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postimplantation+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Essential+Developmental+Biology+A+Practical+Approach%22%5BJournal%5D)">Postimplantation mammalian embryos.</a> Essential Developmental Biology A Practical Approach. , IRL Press. Oxford. 55-66 (1993).</li>
<li>Fujinaga, M. In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFujinaga%2C+M+%22Developmental+Biology+Protocols%22">Developmental Biology Protocols</a>. Tuan, R. S., Lo, C. W. , Humana Press. Totowa. 53-76 (2000).</li>
<li>Eto, K., Takakubo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+development+of+rat+embryos+in+culture+during+the+period+of+craniofacial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Craniofac.+Genet.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis.</a> J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).</li>
<li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li>
<li>Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+craniofacial+embryology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammalian craniofacial embryology in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).</li>
<li>Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+of+the+mouse+prosencephalic+neural+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate.</a> Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).</li>
<li>Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6-dependent+boundary+defines+alignment+of+migrating+olfactory+cortex+neurons+via+the+repulsive+activity+of+ephrin+A5%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5.</a> Development. 133, 1335-1345 (2006).</li>
<li>Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+labeling+of+mouse+rhombomeres+by+Cadherin-6%3A%3AEGFP-BAC+transgenesis+underscores+the+role+of+cadherins+in+hindbrain+compartmentalization%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization.</a> Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).</li>
<li>Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibition+of+cyclin-dependent+kinases+that+lengthens%2C+but+does+not+arrest%2C+neuroepithelial+cell+cycle+induces+premature+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis.</a> J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).</li>
<li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li>
<li>Arai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Fabp7%2C+a+downstream+gene+of+Pax6%2C+in+the+maintenance+of+neuroepithelial+cells+during+early+embryonic+development+of+the+rat+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex.</a> J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).</li>
<li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Existem dois passos críticos no WEC roedores para o sucesso. Primeiro, o procedimento de dissecção deve ser preciso para não danificar embriões, especialmente os vasos sanguíneos. Segundo, o procedimento deve ser o mais rápido possível, porque o oxigênio e nutrientes não são mais fornecidos através da placenta após o isolamento do útero. Isto é crítico para os embriões mais velhos. No caso do WEC de ratos após E12.5, devemos transferir embriões dissecado em garrafas de cultura em 30 minutos. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td colspan="5"> Criação WEC </td></tr><tr><td> WEC sistema (10-0310) </td><td> Ferramenta </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-0310 </td><td> Um outro modelo pequeno também está disponível. </td></tr><tr><td> Silicon plug sem um buraco </td><td> Ferramenta </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-08 </td><td></td></tr><tr><td> Cilindro de mistura de gás </td><td> Ferramenta </td><td> Nikko Sanso </td><td> - </td><td> Contendo 95% de oxigênio e dióxido de carbono de 5%. Ordem feita sob encomenda. </td></tr><tr><td> Regulador de gás </td><td> Ferramenta </td><td> Ono Seisakusho </td><td> WR-11 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 mM filtro Millex GS </td><td> Ferramenta </td><td> Millipore </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Anestesia e isolamento do útero </td></tr><tr><td> Tesouras grandes </td><td> Ferramenta </td><td> Napox </td><td> B-7H </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Ferramenta </td><td> Napox </td><td> A-3-2 </td><td></td></tr><tr><td> Prato disposição Petri (90 mm x 15 mm) </td><td> Ferramenta </td><td> Iwaki </td><td> SH90-15 </td><td> Deep-tipo de prato é o melhor para dissecção. </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Reagente </td><td> Abbott </td><td> B506 </td><td> Para anestesia </td></tr><tr><td> Pentobarbital sódico </td><td> Reagente </td><td> Schering-Plough Saúde Animal </td><td> - </td><td> Para anestesia </td></tr><tr><td> Tyrode de solução salina </td><td> Reagente </td><td> - </td><td> - </td><td> De acordo como o protocolo na Ref. 2. Salvar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Cronometrado grávidas de ratos Sprague-Dawley </td><td> Animal </td><td> Charles Rivers Laboratories Japão </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Preparação de meio de cultura </td></tr><tr><td> Garrafa de vidro cultura </td><td> Ferramenta </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-05 </td><td></td></tr><tr><td> Frasco de cultura disposição </td><td> Ferramenta </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-06 </td><td></td></tr><tr><td> Silicon ficha com buraco </td><td> Ferramenta </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Folha de alumínio </td><td> Ferramenta </td><td> Qualquer empresa </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> Saco de autoclave </td><td> Ferramenta </td><td> Hogy </td><td> HM-26 </td><td> Para garrafas de cultura </td></tr><tr><td> Saco de autoclave </td><td> Ferramenta </td><td> Hogy </td><td> HM-14A </td><td> Para plugues de silicone </td></tr><tr><td> 0,45 mM filtro Millex HA </td><td> Ferramenta </td><td> Millipore </td><td> SLHA033SS </td><td></td></tr><tr><td> 50 tubo cônico ml </td><td> Ferramenta </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 100 ml copo </td><td> Ferramenta </td><td> Iwaki </td><td> TE-32 </td><td></td></tr><tr><td> Rat IC soro </td><td> Reagente </td><td> Charles Rivers Laboratories Japão </td><td> - </td><td> Referem-se a: Sr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81- (0) 45-474-9336; FAX: +81- (0) 45-474-9340 </td></tr><tr><td> D (+)-Glicose </td><td> Reagente </td><td> Wako </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> Antibióticos antimyotic líquido </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Dissecação de embriões </td></tr><tr><td> Tesoura oftálmica reta </td><td> Ferramenta </td><td> Napox </td><td> MB50-7 </td><td> Para o corte da parede uterina </td></tr><tr><td> Tesoura oftálmica curvas </td><td> Ferramenta </td><td> Napox </td><td> MB54-2 </td><td> Para cortar o saco vitelino </td></tr><tr><td> Fórceps # 5 </td&gt; <td> Ferramenta </td><td> Vigor </td><td> T6715 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps # 5F </td><td> Ferramenta </td><td> Regine </td><td> T6819 </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta de vidro </td><td> Ferramenta </td><td> - </td><td> - </td><td> Feito à mão usando pipeta Pasteur. </td></tr><tr><td> Saco de autoclave </td><td> Ferramenta </td><td> Hogy </td><td> HM-4 </td><td> Para pipetas de vidro </td></tr><tr><td> Microscópio binocular </td><td> Ferramenta </td><td> Leica </td><td> Mz7s </td><td></td></tr><tr><td> Luz </td><td> Ferramenta </td><td> Leica </td><td> CLS 150XD </td><td></td></tr><tr><td> Óleo de pedra </td><td> Ferramenta </td><td> Yoko Uchida </td><td> 833-2000 </td><td> Para afiar de fórceps </td></tr><tr><td> Óleo de máquina </td><td> Ferramenta </td><td> Yoko Uchida </td><td> 835-0000 </td><td> Para afiar de fórceps </td></tr></tbody></table>

o método de cultura de embriões de roedores inteiro usando o rotator do tipo sistema de cultura garrafa

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Todo embrião cultura técnica (WEC) foi desenvolvido em 1950 pela Nova e seus colegas, e aplicadas em biologia do desenvolvimento 1. Embora o desenvolvimento e crescimento de embriões de mamíferos dependem criticamente a função da placenta, WEC técnica nos permite rato cultura e embriões de ratos condição de ex vivo durante períodos limitados, correspondendo a fases midgestation durante o dia embrionário (E) 6,5 E12.5 na mouse ou E8.5-E14.5 no rato 2, 3, 4. No WEC, nós podemos diretamente alvo desejado áreas de embriões utilizando capilares de vidro fina porque os embriões podem ser manipulados sob o microscópio. Portanto, WEC roedores é uma técnica muito útil quando queremos estudar processos dinâmicos de desenvolvimento de embriões de mamíferos postimplanted. Até à data, vários tipos de sistemas têm sido desenvolvidos WEC 1. Entre estes, o rotator-tipo de sistema de cultura de garrafa é mais popular e adequada para longo prazo de cultura de embriões em midgestation, ou seja, após E9.5 e E11.5 em camundongos e ratos, respectivamente 1. Neste protocolo de vídeo, demonstramos nossos procedimentos padrão de WEC ratos após E12.5 usando um modelo refinado do sistema original rotador, que foi desenhado por New Cockroft e 5, 6, e introduzir várias aplicações da técnica do CME para estudos em desenvolvimento de mamíferos biologia.

Técnica de cultura todo embrião de rato permite-nos cultura e embriões de ratos<em&gt; Ex vivo</em&gt; Condição durante períodos limitados, correspondendo a fases midgestation. Neste protocolo de vídeo, demonstramos nossos procedimentos padrão de cultura de embriões de ratos após toda E12.5 usando o rotator-tipo de sistema de cultura de garrafa.

O método de cultura de embriões de roedores inteiro usando o Rotator do tipo Sistema de Cultura Garrafa

A técnica de cultura de embrião inteiro (WEC) foi desenvolvida na década de 1950 por New e seus colegas, e aplicada à biologia do desenvolvimento 1. Embora o desenvolvimento ...

Na Biologia do desenvolvimento, existem vários animais utilizados para experimentos. A técnica agrícola havaiana de rotação de embriões foi estabelecida na década de 1950 e aprimorada antes do estabelecimento da manipulação genética moderna na agricultura havaiana. O método direto enfraquecido visa diretamente áreas de desenvolvimento com morte ou transfeção de genes, já que os embriões podem ser manipulados e observados ao microscópio; portanto, a cultura completa de embriões é uma ferramenta muito útil.Quando queremos estudar o processo dinâmico de desenvolvimento de embriões murinos após a implantação, o crescimento dos embriões murinos depende criticamente do apresentador funcional, o que limita o período de cultura. Em geral, podemos cultivar embriões durante o período do dia embrionário 8,5 a 14,5 na rata e do E 6,5 a 12,5 no camundongo.No laboratório, cultivamos embriões de rato e de camundongo utilizando um sistema de cultura rotativo. Esse sistema de cultura é o mais popular e adequado para a cultura de embriões de rato e de camundongo durante o período gestacional avançado, ou seja, após E 11,5 e 9,5 em ratos e camundongos.Neste vídeo, gostaríamos de apresentar nosso prot

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra a preparação de culturas primárias de neurônios a partir de embriões midgastrula estágio Drosophila. Pontos de vista de culturas vivas mostram as células de 1 hora após o plaqueamento e neurônios diferenciados após 2 dias de crescimento em um meio de bicarbonato baseado definido. Os neurônios são eletricamente excitáveis ​​e formam conexões sinápticas.

Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

Este vídeo demonstra nova cultura, um método pelo qual embriões de galinha são cultivadas fora do ovo por até 24 horas. Este método permite o estudo do desenvolvimento inicial (linha primitiva para 14 som.), Um período correspondente ao E7-9 no mouse. Aplicações desta técnica incluem eletroporação, hibridização in situ e imunohistoquímica.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

Neste artigo, apresentamos uma metodologia simples para ativar a longo...

Um Ex-ovo Sistema de Cultura de embriões de frango Indicado para aplicações de imagem e Microcirurgia

Um método que permite a manipulação farmacológica direta de embriões de camundongos durante a neurulação que ultrapassa o metabolismo materno é descrito. A técnica pode ser adaptada para estudar os diferentes aspectos da neurulação, variando o ponto de tempo e agente farmacológico.

Fechamento do tubo neural no embrião do rato Cultura Whole

Nós descrevemos uma metodologia rápida para isolar e cultivar os neurônios do hipocampo e cortical a partir de embriões de roedores. Este protocolo permite a realização de experimentos em que quase puras culturas neuronais são necessários.

Isolamento e cultivo de células neurais embrionárias de ratos: um protocolo rápido

Cultura de lâminas de facilitar a manipulação do gene de desenvolvimento do embrião e perturbações farmacológicas. No entanto, as condições de cultura devem assegurar que o desenvolvimento normal pode prosseguir dentro do ambiente reduzido da fatia. Ilustramos um protocolo que facilita o desenvolvimento normal, medula espinhal prosseguir durante pelo menos 24 horas.

Embrião de galinha Spinal Cord Protocolo Cultura Slice

Soro utilizado em culturas de embriões contém componentes desconhecidos que podem afetar o resultado de experimentos especialmente em estudos que envolvem interações de sinalização. Aqui, utilizamos um sistema de cultura oxigenado sem soro e mostram que os embriões no meio da gestação rato cultivadas durante 16-40 horas apresentam desenvolvimento morfológico comparável aos embriões em desenvolvimento in utero.

Rato Desenvolvimento Embrionário em todo um sistema de cultura de embriões sem soro

A cultura de embriões inteiros de mamíferos (WEC) é amplamente utilizada em teratologia e biologia do desenvolvimento. O soro de rato imediatamente centrifugado é comumente fornecido como meio para WEC de camundongo e rato. Neste vídeo, demonstramos nosso protocolo padrão para a preparação de soro de rato de alta qualidade adequado para WEC de mamíferos.

Preparação de Rat Serum Indicado para cultura de embriões de mamíferos Whole

Demonstramos um método para enxertar células cultivadas em locais definidos de embriões de camundongos iniciais para determinar seu potencial in vivo. Também introduzimos um método de eletroporação otimizado que usa capilares de vidro de diâmetro conhecido, permitindo a entrega precisa de DNA exógeno em algumas células dos embriões.

Métodos de Transferência Precisamente localizada de células ou DNA em adiantado postimplantation embriões de camundongos

Uma plataforma aprimorada para a cultura de embriões integrais permite o desenvolvimento contínuo e robusto do ex útero de embriões de camundongos pós-implantação por até seis dias, desde estágios de pré-estresculação até organogênese avançada. Neste protocolo, detalhamos o procedimento padrão para a cultura de embriões bem sucedida usando placas estáticas e sistemas de garrafas rotativas.

Ex Utero Cultura de Embriões de Camundongos de Pregastrulation a Organogênese Avançada

Este protocolo descreve metodologias para estabelecer um modelo simples e eficiente de implantação embrionária in vitro para avaliar as moléculas relevantes que afetam o processo de implantação embrionária.

Estabelecimento de um Modelo de Implantação Embrionária In Vitro

Aprenda a técnica de cultura de embriões inteiros de roedores usando o sistema rotativo de cultura em garrafa. Este método permite estudar processos de desenvolvimento em condições controladas ex vivo.

O método de cultura de embriões de roedores inteiro usando o Rotator do tipo Sistema de Cultura Garrafa

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