O método de cultura de embriões de roedores inteiro usando o Rotator do tipo Sistema de Cultura Garrafa
28 de agosto de 2010
Técnica de cultura todo embrião de rato permite-nos cultura e embriões de ratos Ex vivo Condição durante períodos limitados, correspondendo a fases midgestation. Neste protocolo de vídeo, demonstramos nossos procedimentos padrão de cultura de embriões de ratos após toda E12.5 usando o rotator-tipo de sistema de cultura de garrafa.
Na Biologia do desenvolvimento, existem vários animais utilizados para experimentos. A técnica agrícola havaiana de rotação de embriões foi estabelecida na década de 1950 e aprimorada antes do estabelecimento da manipulação genética moderna na agricultura havaiana. O método direto enfraquecido visa diretamente áreas de desenvolvimento com morte ou transfeção de genes, já que os embriões podem ser manipulados e observados ao microscópio; portanto, a cultura completa de embriões é uma ferramenta muito útil.
Quando queremos estudar o processo dinâmico de desenvolvimento de embriões murinos após a implantação, o crescimento dos embriões murinos depende criticamente do apresentador funcional, o que limita o período de cultura. Em geral, podemos cultivar embriões durante o período do dia embrionário 8,5 a 14,5 na rata e do E 6,5 a 12,5 no camundongo.
No laboratório, cultivamos embriões de rato e de camundongo utilizando um sistema de cultura rotativo. Esse sistema de cultura é o mais popular e adequado para a cultura de embriões de rato e de camundongo durante o período gestacional avançado, ou seja, após E 11,5 e 9,5 em ratos e camundongos.
Neste vídeo, gostaríamos de apresentar nosso protocolo padrão para cultura em jejum utilizando embriões RU de E 12,5. Nessas condições, o embrião pode ser cultivado por dois dias, tempo suficiente para examinar várias manipulações eficazes na agricultura hor. Existem dois passos críticos para o sucesso.
Primeiro, o procedimento de dissecação deve ser preciso para não danificar o embrião, especialmente os vasos rodenes. Segundo, o procedimento deve ser o mais rápido possível. Isso é especialmente verdadeiro para embriões mais velhos.
Por exemplo, no caso de embriões de camundongo E 10,5, estes devem ser transferidos dentro de 30 minutos. Aplicamos a técnica de cultura de embrião inteiro para cultivar seis embriões mutantes. Por exemplo, analisamos o padrão de migração de células neurocristais no mutante marcando um pequeno número de células com corante ou transplantando células de nível nos embriões de tipo selvagem e fundo mutante.
Além disso, estabelecemos um método de transferência gênica para embriões de camundongo e de rã cultivados por eletroporação, que utiliza choque elétrico. Podemos introduzir simplesmente construtos de genes exógenos, formas dominantes negativas e siRNAs na região dos cérebros em desenvolvimento. Portanto, podemos analisar facilmente as funções gênicas por meio de experimentos de perda e ganho de função.
Também investigamos o comportamento de células marcadas com GFP ou RFP utilizando cultura de órgãos ou cultura de fatias, seguida ou não de agricultura. Assim, é possível realizar uma variedade de experimentos usando a cultura Lio em combinação com outras técnicas.
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Visão Geral
Este protocolo em vídeo demonstra a técnica de cultura de embrião inteiro para embriões de rato após E12,5, utilizando um sistema de cultura em frasco do tipo rotativo. Este método permite a cultura ex vivo durante as fases críticas da metade da gestação.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia do Desenvolvimento
- Embriologia
- Técnicas de cultura ex vivo
Contexto
- A técnica de cultura de embrião inteiro foi estabelecida desde a década de 1950.
- Ela permite a manipulação de embriões para estudos genéticos.
- Os embriões podem ser cultivados durante períodos específicos de desenvolvimento.
- O crescimento depende da presença funcional do embrião.
Objetivo do Estudo
- Estudar os processos dinâmicos de desenvolvimento de embriões após a implantação.
- Fornecer um procedimento padronizado para cultura de embriões inteiros.
- Facilitar a pesquisa em biologia do desenvolvimento.
Métodos Utilizados
- Técnica de cultura de embrião inteiro
- Sistema de cultura em frasco do tipo rotativo
- Condições ex vivo para embriões de rato
- Períodos de cultura do 8,5º ao 14,5º dia embrionário
Resultados Principais
- Cultura bem-sucedida de embriões de rato após E12,5.
- Demonstração de procedimentos padrão para manipulação de embriões.
- Compreensão dos períodos críticos de crescimento dos embriões.
- Estabelecimento de um método confiável para estudos futuros.
Conclusões
- A técnica de cultura de embrião inteiro é uma ferramenta valiosa na biologia do desenvolvimento.
- Ela permite o estudo do desenvolvimento embrionário em condições controladas.
- Métodos padronizados aumentam a reprodutibilidade na pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O sistema de cultura de embrião inteiro do tipo rotativo permite a manipulação direta e a observação de embriões de roedores durante estágios críticos da metade da gestação, apoiando a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. Esta plataforma ex vivo possibilita intervenções genéticas e celulares precisas, facilitando a validação funcional de alvos e a investigação de vias antes de estudos in vivo. Sua reprodutibilidade e adaptabilidade tornam-no um recurso valioso para pesquisas translacionais e triagem de portfólios em modelagem do desenvolvimento e de doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite manipulação genética ou celular direta para validação funcional de alvos em embriões de mamíferos.
- Contribui para a redução de riscos mecanicistas ao permitir estudos de perda e ganho de função em um sistema controlado ex vivo.
- Facilita a elucidação de vias e a verificação de hipóteses em pontos críticos de inflexão do desenvolvimento.
- Oferece uma plataforma para avaliar o impacto de intervenções candidatas no desenvolvimento embrionário.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas embrionários validados e manipuláveis para triagem fenotípica subsequente ou ensaios mecanicistas.
- Permite a avaliação reprodutível e quantitativa dos resultados do desenvolvimento após perturbações genéticas ou químicas.
- Apoia a padronização e escalabilidade de ensaios para estudos comparativos entre genótipos ou intervenções.
- Permite a avaliação confiável da função de compostos ou genes em um contexto fisiologicamente relevante.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com estágios desenvolvimentais relevantes para doenças, permitindo modelar distúrbios congênitos ou função gênica.
- Proporciona continuidade do descobrimento à validação pré-clínica, possibilitando estudos mecanicistas em embriões intactos.
- Apoia decisões de avanço com ajuste de risco ao esclarecer precocemente as vulnerabilidades desenvolvimentais na fase inicial do processo.
- Facilita a descoberta e validação de biomarcadores em um sistema controlado e passível de manipulação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O sistema rotativo de WEC integra a descoberta inicial e a pesquisa pré-clínica, permitindo a manipulação orientada por hipóteses e a análise quantitativa do desenvolvimento embrionário. Situado entre ensaios in vitro e modelos in vivo, oferece uma plataforma única para estudos mecanicistas e redução de riscos em alvos terapêuticos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias por meio de intervenção genética ou celular direta.
- Triagem: Fornece sistemas embrionários prontos para ensaios e reproduzíveis para leituras fenotípicas quantitativas.
- Análises: Permite a medição de desfechos desenvolvimentais, migratórios ou moleculares para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas mecanicistas iniciais à modelagem pré-clínica de doenças e à validação de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada e adaptável para uso repetido em diversos programas de descoberta.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Fornece fluxos de trabalho ex vivo padronizados, reprodutíveis e escalonáveis para estudos de desenvolvimento.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper projetos e a eficiência do capital ao esclarecer riscos biológicos precocemente.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de ativos em fase de descoberta.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em embriologia, microdissecação e técnicas de manipulação ex vivo.
- Requer instrumentação especializada de cultura em frascos rotativos e infraestrutura de microscopia.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes linhagens de roedores ou estágios de desenvolvimento.
- O período de cultura é limitado pela dependência embrionária da função placentária, restringindo a janela de análise.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:00
The Method of Rodent Whole Embryo Culture Using the Rotator-type Culture System
2:06
Setting up Whole Embryo Culture System
3:53
Removal of Embryos from the Uterus
2:52
Preparation of Culture Medium
4:52
Dissection of Rat Embryos
7:27
Results and Discussion
0:07
Introduction
