Name: Preparação de tendões da cauda de rato de Estudos biomecânicos e Mechanobiological (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-30T17:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Aprenda a preparar tendões da cauda de rato para estudos biomecânicos e mecanobiológicos. Este método demonstra extração, medição de área e carregamento em bioreator, mantendo viabilidade tecidual.

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Este artigo foi apoiada pelo Grant NSERC # 299280, IRSST como uma bolsa de estudos para G. Pais e FRSQ como um prêmio de graduação de estudantes de pesquisa para M. Cyr. Agradecemos a Yoan Lemieux-Laneville para realizar as manipulações gravadas em vídeo.

Antes de qualquer manipulação, é preciso identificar o grupo de tendões para ser usado, dependendo da experiência que estão a realizar e os aparelhos à sua disposição. Para os nossos propósitos, tendões ventral foram escolhidos porque são menores e, portanto, mais fácil de manipular durante a medição da área transversal e equipando-os para dentro da câmara biorreator. Por favor note que todos os instrumentos são autoclavados ou esterilizados com álcool 70%. Além disso, um frasco de spray contendo álcool 70% é colocado ao lado de cada estação de trabalho para esterilizar as luvas experimentadores antes de cada operação. Parte 1: Extração Após a ressecção, a cauda é cuidadosamente manipulado por suas extremidades para evitar danificar os tecidos. Além disso, para conservar a viabilidade celular, todas as manipulações são realizadas em solução salina gelada. 1A) Materiais: <ul><li> Solução salina fria (D-PBS) </li><li> Gelo picado </li><li> Protetor de superfície </li><li> Tábua </li><li> Placas individuais de manipulação </li><li> 2 500 pratos ml </li><li> 2 2L pratos de vidro </li><li> Fita adesiva </li><li> Uma pinça </li><li> 1 Pinça </li><li> Uma pinça ficar </li><li> 1 par de tesouras cirúrgicas </li><li> Um bisturi </li><li> 1 par de tesouras cirúrgicas <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Manipulação individual com a identificação de orientação ("P" para "proximal") </li></ul> 1B) Estação de Trabalho: <ol><li> Espalhar o protetor de superfície e coloque a placa de corte na parte superior. </li><li> Preencher cada dois pratos de vidro para maior até a metade com gelo picado e coloque-os no papel. </li><li> Furar um pedaço de fita em um canto da placa de manipulação e identificar com uma letra para indicar o fim proximal. </li><li> Preencha os dois pratos de vidro pequeno para a metade e todas as ranhuras das placas de manipulação com soro fisiológico frio. Colocá-los nos pratos de vidro grande contendo gelo. </li><li> Organizar todos os instrumentos esterilizados no protector de superfície. </li><li> Transferência da cauda em um dos prato de vidro contendo solução salina. </li></ol> 1C) Manipulações: <ol><li> Observar a anatomia da extremidade proximal da cauda para distinguir o lado ventral do lado dorsal. O lado ventral tem um maior número de tendões e vasos sanguíneos que pode ser verificado pressionando ligeiramente a cauda para produzir pequenas gotas de sangue. </li><li> Usando a tesoura cirúrgica, cortar a pele ao longo do lado dorsal da cauda se você quer extrair os tendões ventral (ou ao longo do lado ventral se precisar os tendões dorsal). </li><li> Abrir a incisão na extremidade proximal e remover a pele com a pinça ou com os dedos e com cuidado manipular as extremidades da cauda. </li><li> Enxaguar o sangue e cabelo em solução salina e transferir a amostra no prato de vidro contendo solução fresca restantes. Mudar de luvas. A seção transversal visto sob microscopia de luz mostra os grupos tendão seis. Um tendão de cada grupo é unido à extremidade caudal de cada vértebra, por isso cortamos no disco intervertebral para expor novas tendões ao longo do corte. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Secção transversal da cauda de ratos visto sob microscopia de luz. </li><li> Corte a extremidade distal através da cartilagem 2-3 vértebras mais curto com uma tesoura cirúrgica. Coloque a cauda na tábua de corte para cortar os tecidos moles, usando um bisturi e imediatamente substituí-lo na solução. </li><li> Usando uma pinça, puxe um tendão da cauda distal. </li><li> Com uma retenção suave em ambas as extremidades, coloque o tendão na placa de manipulação individual. Repita os dois últimos passos até que não mais pode ser tendões brincou e cortar uma vértebra mais curta sempre que novos tecidos precisam ser expostos. </li></ol> Parte 2: transversal medição da área 7 Quando o tecido sofre caracterização mecânica ou estimulação, suas propriedades mecânicas são descritos por normalizar a força no interior do tendão ao estresse. É por isso que nós avaliamos área transversal. 2A) Materiais: <ul><li> Micrômetro óptica </li><li> Estereomicroscópio </li><li> Câmera digital </li><li> Reconhecimento de ponta e algoritmos de reconstrução 5,6 Perfil </li><li> Solução salina fria (D-PBS) </li><li> 1 pipeta de volume de 20 200μL Micro </li><li> Uma chave de Hex para ajustes micrômetro óptico </li><li> 2 Pinças / Files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg "alt =" Figura 3 "/&gt; Figura 3. Micrômetro Optic </li></ul> 2B) Estação de Trabalho: <ol><li> Abra o software (câmera digital e algoritmos). </li><li> Coloque o micrômetro óptico para que haja espaço suficiente para carregar o tendão no aparelho. </li><li> Organizar os instrumentos e prato de vidro contendo os tendões extraídos à mão. </li></ol> 2C) Manipulações: <ol><li> Encha o compartimento de medição com solução salina fria até que ambos os sistemas de ancoragem são submersas. </li><li> Transferência do tendão no compartimento, segurando as pontas com uma pinça. </li><li> Usando a pipeta de sucção através de micro-volume, puxe uma extremidade de cada vez para dentro do tubo de silício. Aspirar até o final se estende além do eixo colares. </li><li> Aperte os colares de eixo para comprimir os tubos e instale o aparelho sob o estereomicroscópio. </li><li> Com ampliação de 105X, esticar os tendões, enquanto observa o tecido até os vincos já não são perceptíveis. Estiramento por 0,40% adicionais. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Projeção do tendão com ampliação de 105x antes e após o alongamento. </li><li> Ajustar a posição e se concentrar para manter uma imagem clara do tendão mais de uma rotação de 180 °. </li><li> Tirar uma foto a cada 10 ° de rotação, sem alterar o foco de tensão, ou posição. Use apenas o eixo rotativo para realizar a rotação. Devido à sua forma de cone, estes passos podem ser repetidos em diferentes pontos ao longo do tendão. </li><li> Ativar o reconhecimento de ponta e algoritmos de reconstrução do perfil, a fim de analisar o banco de dados que você registrou. </li><li> Livre do tendão soltando os colares de eixo e soprando ar para dentro dos tubos de silicone usando a pipeta de volume micro. </li><li> Reinserir o tendão na placa de manipulação, manuseá-lo novamente pelas extremidades. </li><li> Verificar a forma de a reconstrução do perfil obtido eo valor da área transversal. </li></ol> Parte 3: lavagem Para remover a contaminação que pode ter ocorrido durante as manipulações anterior, os tecidos são lavados sob biossegurança gabinete. 3A) Materiais: <ul><li> Solução salina fria (D-PBS) </li><li> Múltiplas-groove placa manipulação </li><li> Individuais placas de Manipulação </li><li> Fita adesiva </li><li> 2 Pinças </li><li> Uma pinça ficar </li></ul> 3B) Estação de Trabalho: <ol><li> Ligue o ventilador na cabine de segurança biológica 15 minutos de antecedência e limpar as superfícies internas com álcool a 70%. </li><li> Trazer todos os instrumentos dentro da cabine de segurança biológica. </li><li> Vara pedaços de fita adesiva em um canto de cada prato individual para identificar a extremidade proximal. </li><li> Preencher todas as ranhuras com solução salina estéril. </li></ol> 3C) Manipulações: <ol><li> Introduzir a placa de manipulação contendo o tendão extraído no gabinete. </li><li> Usando uma pinça, remova o tendão de seu prato com um aperto suave em cada extremidade. </li><li> Mergulhar e agitar suavemente o tendão na solução salina de cada compartimento da placa de manipulação de múltipla groove, a partir de mais próximo e prosseguindo ao ritmo mais longe. </li><li> Finalmente submergir, o tendão em uma placa de manipulação individual. </li></ol> Parte 4: Carregando em biorreator câmara Para evitar maior contaminação, as manipulações a seguir também são realizadas no gabinete de biossegurança. 4A) Materiais: <ul><li> Biorreator de 4 câmaras </li><li> Âncoras estéril </li><li> Uma placa de Petri estéril </li><li> Médio cela fria cultivados (DMEM) </li><li> Cianoacrilato </li><li> 2 Pinças </li><li> Pinças pé </li><li> 0.5-10μl pipeta Micro-volume </li><li> 1 Régua <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Biorreator câmara </li></ul> 4B) Estação de Trabalho: <ol><li> Desde a etapa anterior também foi realizado em biossegurança do gabinete, remoção de ferramentas desnecessárias lhe dará mais espaço de trabalho. </li><li> Trazer todos os outros instrumentos dentro do armário. </li></ol> 4C) Manipulações: <ol><li> Coloque uma âncora na placa de manipulação com o seu spool centrado sobre a extremidade do tendão e ferir o tecido para cima e ao redor do carretel. </li><li> Rolar a âncora mais e segure a extremidade solta, garantindo que o tecido fica preso à âncora. Parar após ¾ vez. </li><li> Realizar o mesmopassos com a outra extremidade. </li><li> Rolar duas âncoras sobre igual até que é de 6 cm entre seus centros 1. </li><li> Solte o tendão para mergulhá-lo na solução e permitir que as seções ancoradas para secar rapidamente para melhorar suas propriedades mecânicas 2-3. </li><li> Despeje cianoacrilato em placa de Petri e desenhar 2.5μL na pipeta de volume micro. </li><li> Aplique uma gota de cianoacrilato no tecido liquidada sem deixar cair nenhuma cola na solução salina. Repita até 2 gotas foram aplicadas a cada âncora. </li><li> Com o tendão ainda completamente imerso, aguarde 5 minutos para a cola secar completamente. </li><li> Durante este tempo, encher o compartimento de câmara com solução salina. </li><li> Hidratar todos os tecidos com solução salina para evitar danos. </li><li> Manipulando apenas as âncoras, a transferência do tendão na câmara biorreator e fechá-lo para evitar vazamento e contaminação durante a transferência. </li></ol> Parte 5: Resultados Representante: O resultado do protocolo mostra que quando feita corretamente, nosso isolamento do tecido rigoroso procedimento de preparação e torná-lo possível para manter a esterilidade dos tecidos, viabilidade e integridade. Primeiro, usando o método de extração simples e repetitivas, que são capazes de extrair tendões da cauda sem danificar a rede de colágeno como pode ser observado por uma análise microscópica de H &amp; E seções contaminado realizada após a extração. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Rede de colágeno do tendão após a extração (5m seção longitudinal corados com H &amp; E). Em seguida, tendões cultivadas por até dez dias e realizou testes de esterilidade. Cada dia, solução de cultura banhado usado em agar e incubado por 24 horas. Uma vez que não foi observado crescimento bacteriano, concluímos que nossas manipulações não resultam em contaminação. Com o algoritmo de reconstrução perfil e micrômetro óptico, somos capazes de estimar a área transversal dentro de uma margem de 2% de erro 7. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Reconstrução do perfil de um RTT. Finalmente, avaliamos a viabilidade usando o LIVE / MORTOS Kit de Viabilidade / citotoxicidade para células de mamíferos após a etapa de lavagem e após um período de cultura de doze dias. Uma vez que a grande maioria dos verde fluorescente de células vivas eram evidentes, podemos confirmar que os nossos procedimentos de isolamento são bem sucedidos na preservação do tecido vivo. O mesmo teste foi realizado duas horas depois de prender o tendão para dentro da câmara biorreator. Verificou-se que a desidratação e cola na âncora não havia se espalhado no tecido entre as duas âncoras. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Viabilidade do tecido na âncora (verde = células vivas, vermelho = células mortas)

<ol><li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Zool.+Lond%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li>
<li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22D%C3%A9shydratation+de+matrices+collag%C3%A9niques+reconstruites+in+vitro%3A+effets+sur+les+propri%C3%A9t%C3%A9s+m%C3%A9caniques+et+histologiques+%5B%5D%22">Déshydratation de matrices collagéniques reconstruites in vitro: effets sur les propriétés mécaniques et histologiques [dissertation]</a>. , Québec, Université Laval. Québec. 114-114 (1981).</li>
<li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li>
<li>Huppé, N., Lessard, J. -L., Langelier, E. A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).</li>
<li>Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &amp, Rancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+profiles+and+volume+reconstructions+of+soft+tissues+using+laser+beam+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements.</a> J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).</li>
<li>Lee, T. Q., Woo, S. L. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+determining+cross-sectional+shape+and+area+of+soft+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues.</a> J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).</li>
<li>Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &amp, Langelier, E. Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aplicando os procedimentos experimentais, podemos realizar uma grande variedade de estudos in vitro sobre este tipo de tecidos. Como por exemplo, um estudo sobre a degeneração do tecido foi realizada pela aplicação de sub-estimulação para RTTs por um período de 10 dias. Cada dia, nós avaliamos as propriedades mecânicas do tecido em ensaios não-destrutivos de relaxamento stress. No final, pudemos observar variação de tensão RTT e, portanto, analisar a evolução das propriedades mecânicas. <p class="j...

<table><tbody><tr><td>D-PBS </td><td>Reagente</td><td>Wisent Inc.</td><td>311-410-CL</td><td>Solução salina</td></tr><tr><td>Glicose </td><td>Reagente</td><td>Wisent Inc.</td><td>609-037-EL</td><td>Solução salina&lt;br/&gt;1g/L</td></tr><tr><td>Antibióticos-antimicóticos </td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Solução salina&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td>Solução de cultura</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Reagente</td><td>Wisent Inc.</td><td>600-105-CG</td><td>Solução de cultura&lt;br/&gt;3,7g/L</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Reagente</td><td>Wisent Inc.</td><td>090150</td><td>Solução de cultura&lt;br/&gt;10%</td></tr><tr><td>Antibióticos-antimicóticos</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Solução de cultura&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>Micrômetro óptico</td><td>Ferramenta</td><td>Produzido sob encomenda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de manipulação</td><td>Ferramenta</td><td>Produzida sob encomenda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara de biorreator</td><td>Ferramenta</td><td>Produzida sob encomenda</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de tendões da cauda de rato de estudos biomecânicos e mechanobiological

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Tendões de ratos de cauda (RTTs) são um modelo comum biológicos utilizados em estudos experimentais in vitro nas áreas de fisiologia do tendão e tendinopatia. Trabalhando com esses tecidos é um desafio, porque eles são muito frágeis, e até agora não havia nenhum protocolo rigorosamente detalhadas para o seu isolamento. Diante desses desafios, temos desenvolvido métodos e instrumentos para facilitar a manipulação de RTTs e tecido controle de viabilidade esterilidade e integridade. Este artigo descreve os procedimentos experimentais usados ​​para preparar RTTs para estudos biomecânicos e mechanobiological. Nosso trabalho é dividido em quatro etapas principais: extração, transversal medição da área, lavagem e carregamento na câmara biorreator. A cada passo, todos os procedimentos, materiais e manipulações são apresentados em detalhe, para que possam ser facilmente reproduzidos. Além disso, os instrumentos específicos desenvolvidos são apresentados: uma placa de manipulação usada para segregar RTTs, um micrômetro óptico para posicionar o tecido durante a medição da área transversal e um sistema de ancoragem para fixar a RTTs em um biorreator. Por fim, descrevemos os resultados obtidos após vários testes para validar os nossos métodos. Avaliações a viabilidade de esterilidade e integridade demonstrar que os nossos procedimentos são suficientemente rigorosas para manipulações de tecidos frágeis, como os tendões da cauda de rato.

Este artigo descreve os procedimentos experimentais usados ​​para preparar os tendões da cauda de rato para estudos biomecânicos e mechanobiological. Várias características dos principais passos na preparação são demonstrados, começando com a extração, transversal medição da área, lavagem e carregamento na câmara biorreator.

Preparação de tendões da cauda de rato de Estudos biomecânicos e Mechanobiological

Os tendões da cauda de rato (TCRs) são um modelo biológico comum utilizado em estudos experimentais in vitro nas áreas de fisiologia do tendão e tendinopatia. Trabalhar...

O vídeo que você está prestes a ver contém os procedimentos experimentais utilizados para isolar e preparar o tendão da cauda de rato para estudos biomecânicos e biológicos mecânicos. O objetivo deste artigo é demonstrar os métodos e instrumentos que foram desenvolvidos e otimizados com o intuito de manter a viabilidade tecidual, a esterilidade e a integridade durante o procedimento de preparação. Discutiremos várias características relativas às etapas principais do preparo, começando pela extração, seguida pela medição da área da seção transversal, enxágue e, finalmente, o carregamento na câmara do biorreator.Vamos começar. A extração é o primeiro passo do preparo para conservar a viabilidade celular. Todas as suas manipulações são realizadas em solução salina fria.Após a anestesia, a cauda é ressecada, lavada com etanol 70% e transferida para uma placa contendo solução celular e mantida em gelo. Para facilitar a extração do tendão, a pele deve ser removida. Levando em consideração que trabalhamos com tendões ventrais.Como são menores e mais fáceis de manipular com nosso equipamento, é feita uma incisão ao longo do lado dorsal da cauda. Em seguida, a orientação correta da cauda é verificada observando a anatomia na extremidade proximal. Como podemos ver, o lado ventral apresenta um número maior de tendões, e a presença de um vaso sanguíneo pode ser confirmada pelas gotas de sangue obtidas.Ao apertar suavemente a cauda, realiza-se a incisão, partindo da extremidade proximal e utilizando um par de tesouras cirúrgicas. Toma-se o cuidado de manipular a cauda por suas extremidades.Quando a incisão é concluída, a pele é removida, começando também pela extremidade proximal com os dedos ou com uma pinça. Mais uma vez, toma-se cuidado para manipular a cauda pelas extremidades. Em seguida, a cauda é lavada na solução para remover pelos e sangue.O espécime é então transferido para uma placa contendo solução fresca e mantido sobre gelo. Neste momento, o pesquisador troca as luvas para expor o tendão. A extremidade distal da cauda é ressecionada com dois a três vértebras a menos.As vértebras são os feixes visíveis entre os feixes de tendões e também podem ser sentidas ao deslizar os dedos ao longo da cauda. Uma vista da microscopia óptica de uma seção transversal realizada ao longo da vértebra. A extremidade Skoal mostra que existem seis grupos diferentes de tendões, já que o tendão de cada um deles está ligado à vértebra, e que estamos utilizando apenas os tecidos ventrais.Quatro tendões são puxados em cada corte, dois dos grupos inferiores e dois dos grupos laterais. Para realizar a ressecção, você pode usar tesoura cirúrgica para romper o disco intervertebral e um bisturi sobre uma tábua de corte para os tecidos moles. Neste ponto, o lado ventral é reconhecido pela presença de esponjas tendíneas maiores.Uma vez verificada a orientação, o tendão é cuidadosamente extraído a partir da extremidade distal usando uma pinça; quando não é mais possível separar tecidos, a cauda é ressecada no nível do ombro vertebral, conforme mostrado anteriormente. Após a extração, o tecido é imediatamente imerso na solução e, segurando-se ambas as extremidades, o tendão é transferido para uma placa de manipulação que também contém a solução celular e na qual uma fita é usada para identificar a extremidade proximal. Uma análise microscópica de cortes longitudinais corados com hematoxilina e eosina mostra que, ao utilizar este método simples e repetitivo, a selagem do tecido extraído apresenta uma rede de colisões bem delimitada e densamente compactada.Após a manipulação, quando os tecidos sofrem estímulo mecânico, descrevemos suas propriedades mecânicas normalizando a força interna em relação à tensão. Portanto, devemos avaliar sua área da seção transversal. Para tanto, o perfil do tendão é reconstruído utilizando uma microscopia estereoscópica equipada com uma câmera digital.Com este método, a integridade do tecido é preservada, já que a carga ou tensão da neve é aplicada diretamente sobre ele. A câmera digital tira imagens da projeção do segmento em uma visão de 180°. Dentro de um sistema de referência, um algoritmo assistente de visão localiza as bordas superior e inferior da amostra.Em seguida, um algoritmo com o software MATLAB é utilizado para realizar a reconstrução do perfil. Um micrômetro óptico foi projetado para manter o tecido na zona focal. Pois fora dessa região, a projeção é desfocada e o refocamento deslocaria o referencial local.O micrômetro inclui um compartimento de medição para evitar a desidratação do tecido. Dois sistemas de posicionamento com estágio giratório, permitindo a rotação do espécime, e dois dispositivos de fixação feitos com tubos de silicone comprimidos contra as cores do eixo. Primeiro, o compartimento de medição é preenchido com solução celular fria até que a entrada dos tubos de silicone esteja submersa.Em seguida, o espécime é transferido para o compartimento de medição utilizando pinças e segurando apenas suas extremidades. Com uma micropipeta de volume micro, as extremidades do tendão são puxadas por seção para dentro dos tubos de silicone. Em seguida, realiza-se a aspiração até que a extremidade se estenda além das cores do eixo.Uma vez que ambos os lados estejam prontos, as cores do eixo são apertadas usando uma chave de pescoço para comprimir o tubo. Agora que o tendão está fixado, o aparelho é instalado sob o micr cup estéreo. O tendão pode ser observado diretamente na tela do computador com uma ampliação de 105.Para garantir consistência, o tendão é esticado até que as dobras não sejam mais perceptíveis, seguido por uma deformação adicional de 0,4%. Como o espécime é fotografado de zero a 170 graus, é necessário ajustar a posição inicial e o foco para obter uma imagem nítida em toda a circunferência. Na verdade, são tiradas 18 imagens, com o espécime sendo rotacionado em incrementos de 10 graus entre cada vista.Com este método, é possível estimar a área da seção transversal do tendão da cauda de rato sem danificar o tecido. Ao final, obtém-se uma reconstrução do perfil com uma margem de erro de 0,5 a 2%. Após a medição, os tecidos são lavados para prevenir contaminação que possa ter ocorrido durante manipulações anteriores.Uma placa de manipulação estéril contendo solução de fixação fresca é colocada no gabinete, sendo uma usada para o procedimento de lavagem enquanto a outra receberá o tendão lavado. O pesquisador lava sua luva com etanol 70% antes de introduzir o tendão extraído na cabine de segurança biológica. Segurando apenas as extremidades, o tendão é cuidadosamente transferido de poço a poço.Por fim, é transferido para uma placa de manipulação individual contendo também solução estéril de células. Para validação do protocolo, realizamos testes de viabilidade e esterilidade. Primeiramente, a viabilidade celular foi avaliada utilizando o kit de viabilidade e citotoxicidade live/dead para células de mamíferos.Após um cultivo de 12 dias, visualizou-se uma grande maioria de células vivas com fluorescência verde, confirmando que os procedimentos de isolamento são eficazes na preservação do tecido vivo. Em seguida, realizaram-se exames para verificar contaminação do cultivo utilizado. O meio de cultura foi plaqueado em ágar e incubado por 10 dias, período após o qual nenhuma proliferação bacteriana foi observada.Realizamos que nossas manipulações são estéreis. O uso do sistema de fixação explora a vantagem da desidratação tecidual e da cola para espécimes pequenos, como a cauda de rato e tendões, onde a cola penetra no tecido. Isso fixa todas as subunidades, enquanto a desidratação melhora suas propriedades mecânicas para evitar contaminação adicional.Todo o procedimento de carregamento é realizado em uma cabine de segurança biológica, onde todos os instrumentos e componentes da câmara são estéreis. Para a operação de carregamento, a câmara do biorreator é fixada em um dispositivo de posicionamento. Dois braços móveis são ajustados para receber os ancoradouros dos tendões.Uma tampa fecha a câmara para prevenir contaminação. Primeiro, as âncoras são depositadas nas extremidades da placa de manipulação. Seus carretéis são centralizados com o eixo longitudinal do sulco e acima do tendão.O tendão é então enrolado ao redor de uma âncora. A âncora é girada por aproximadamente três quartos de volta enquanto o corpo do tecido permanece na solução. Segurando a extremidade solta, garantimos a fixação do tecido à âncora.O mesmo procedimento é então repetido para a outra extremidade. Uma vez que ambos os lados estão fixados, as âncoras são enroladas ou desenroladas igualmente até que haja seis centímetros entre as duas extremidades. Na parte lesionada dos tendões, são depositadas duas gotas de 2,5 µL de ocreate.Para realizar a adesão, toma-se cuidado. Para evitar colocar cola na solução celular, são necessários no mínimo cinco minutos para que a cola seque completamente. Para validar nosso protocolo, realizamos testes para verificar a influência da cola e da desidratação do ponto de ancoragem na viabilidade do tecido.Após duas horas, observamos que a condição da extremidade não havia se espalhado para fora do tecido. De fato, há um limite de cor bem definido, marcando a fronteira entre as células mortas fluorescentes vermelhas encontradas no ponto de fixação e a maioria das células vivas verdes do corpo do tecido. Enquanto isso, a câmara do biorreator é preenchida com meio de cultura fresco.Uma vez que a ferida de parte do tendão esteja seca, ela é reidratada com a solução celular. Em seguida, o tecido ancorado é transferido para a câmara usando uma pinça. A tampa é fechada para evitar contaminação adicional.O gabarito de posicionamento será removido assim que a câmara for instalada no biorreator. Acabamos de demonstrar como preparar um tendão de cauda de rato para estudos biomecânicos e biológicos mecânicos. Ao aplicar esses procedimentos, podemos realizar uma grande variedade de estudos in vitro nesses tecidos.Por exemplo, um estudo sobre degeneração tecidual foi realizado mediante a aplicação de estímulo subnível por um período de 10 dias. A cada dia, avaliamos o tecido, as propriedades mecânicas e o teste de relaxação de tensão não destrutivo. Ao final, foi possível observar a variação da tensão.Apresentamos evidências de que nossos rigorosos procedimentos de isolamento e preparação permitem manter a viabilidade tecidual, a integridade e a atividade. Obrigado por assistir e boa sorte com seus próprios experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra a preparação cirúrgica e os procedimentos necessários para estudar as respostas contráteis da preparação músculo gastrocnêmio medial de...

Procedimentos para Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriedades contrátil do músculo esquelético

Explantes a partir do sistema de dopamina mesencéfalo e corpo estriado são utilizados num ensaio de matriz de colagénio para...

Dissecção e Cultura do mouse e dopaminérgico do estriado explantes em três dimensões Ensaios matriz de colágeno

Descrevemos um protocolo in vivo para medir a dorsiflexão do pé após estimulação do nervo fibular e contração do compartimento crural anterior do membro posterior do rato. Essas medições são uma ferramenta translacional indispensável para avaliar a patologia do músculo esquelético e as abordagens de engenharia de tecidos para reparo e regeneração muscular.

aplicações de<em&gt; In Vivo</em&gt; Teste Funcional do Rato tibial anterior para a Avaliação da engenharia de tecidos Repair Músculo Esquelético

Este protocolo descreve o processo de avaliação de cura os tendões em ratos que foram injetados com plasma rico de alogênico plaquetas (PRP) ou solução salina após a remoção de parte do tendão de Aquiles. O progresso da cicatrização do tendão é avaliado em vários pontos de tempo usando diferentes tipos de análises.

Efeitos de alogênico Plasma rico em plaquetas (PRP) sobre o processo de cicatrização dos tendões de Aquiles seccionados de ratos: uma descrição metodológica

Este paper descreve a preparação e avaliação do cordão umbilical células-tronco mesenquimais derivadas de matriz de esferoides com um modelo de defeito bilateral do tendão patelar em um rato. Este modelo foi associado com uma morbilidade aceitável e foi encontrado para detectar diferenças entre tendões tratados e não tratados e entre os dois tratamentos testado.

Avaliação de terapias de células-tronco em um modelo de lesão do tendão patelar Bilateral em ratos

Neste artigo, apresentamos um protocolo in vitro e in situ para reparar uma lacuna tendinosa de até 1,5 cm, preenchendo-a com enxerto de colágeno projetado. Isso foi realizado desenvolvendo uma técnica de sutura modificada para levar a carga mecânica até que o enxerto amadurecer no tecido hospedeiro.

Uma nova técnica de sutura tenorrhaphy com enxerto de colágeno projetado por tecido para reparar defeitos grandes do tendão

O protocolo descreve métodos de teste biomecânicos de tração eficientes e reprodutíveis para tendões murinos através do uso de luminárias impressas em 3D personalizadas.

Teste biomecânico de tendões murinos

Este protocolo descreve a preparação de tecido nervoso ciático inteiro de rato para estimulação eletrofisiológica ex vivo e registro em um banho salino ambientalmente regulado, com dois compartimentos e perfumado.

Preparação do Nervo Ciático de Ratos para Neurofisiologia Ex Vivo

Apresentamos uma plataforma experimental personalizada e um protocolo de cultura de tecidos que recria a alteração fibrocartilaginosa impulsionada pelo impacto da inserção do tendão de Aquiles em explantes murinos de membros posteriores com viabilidade celular sustentada, fornecendo um modelo adequado para explorar a mecanobiologia do impacto tendíneo.

Modelo de Explante de Membro Posterior Murino para Estudo da Mecanobiologia do Impacto do Tendão de Aquiles

Aqui, apresentamos um sistema modelo assemblóide para mimetizar o crosstalk celular do tendão entre o tecido central do tendão que suporta carga e um compartimento extrínseco contendo populações celulares ativadas por doença e lesão. Como um importante caso de uso, demonstramos como o sistema pode ser implantado para sondar a ativação de células endoteliais extrínsecas relevantes para a doença.

Engenharia de Assemblóides de Tendão para Sondar Crosstalk Celular em Doenças e Reparos

Aprenda a preparar tendões da cauda de rato para estudos biomecânicos e mecanobiológicos. Este método demonstra extração, medição de área e carregamento em bioreator, mantendo viabilidade tecidual.

Preparação de tendões da cauda de rato de Estudos biomecânicos e Mechanobiological

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