Preparação de rato Imunogénio Pituitária para a indução de hipofisite Auto-Imune Experimental

A hipofisite autoimune é caracterizada por um aumento da glândula pituitária e uma deficiência em um ou mais hormônios hipofisários. Os autoantígenos causadores permanecem desconhecidos. Aqui, é demonstrado um protocolo para preparar proteínas da glândula pituitária de camundongos para uso no estudo desta doença.

Primeiro, as glândulas pituitárias são isoladas de camundongos sacrificados. As hipófises são então homogeneizadas para quebrar mecanicamente as células e liberar proteínas citosólicas. O homogêneo é clarificado por centrifugação de baixa velocidade e avaliado quanto à quantidade por colormetria, ensaio BCA e qualidade por eletroforese em gel de poliacrilamida.

Finalmente, o homogeneizado de proteína aquosa é misturado com um adjuvante oleoso. Essa mistura é então injetada em camundongos para criar um modelo de camundongo semelhante à hipofisite autoimune. Conforme mostrado no vídeo complementar, quatro técnicas foram descritas para induzir hipofisite em animais experimentais.

A técnica apresentada neste artigo, que é a injeção de proteínas hipofisárias, mistura adjuvante de influenza, é a mais antiga, datando da década de 1960. Outras abordagens foram a injeção de glicoproteínas solúveis do vírus da rubéola em 1992, a injeção estereotáxica de um adenovírus diretamente na glândula pituitária em 2002 e o transplante de glândula pituitária de uma cepa de rato sob a cápsula renal de outra cepa de rato em 2010. A principal vantagem da abordagem adjuvante de Florence é que ela é menos invasiva hoje em dia, mais consistente e, acima de tudo, mais precisa na indução de uma doença que se assemelha muito à contraparte humana.

Apesar de ser relatada desde a década de 1960, a técnica adjuvante estrangeira teve um desempenho ruim para a indução de hipofisite. Quando comecei meu trabalho de doutorado, pude obter apenas uma instância e gravidade modestas da hipofisite usando o protocolo adjuvante estrangeiro publicado. As coisas melhoram significativamente quando tenho a ideia de aumentar em dez vezes a quantidade de proteínas pitu contidas na emoção EM.

Embora esses métodos possam fornecer informações sobre a patogênese da hipofisite autoimune, eles também podem ser usados para estudar outras doenças autoimunes para as quais os autoantígenos ainda precisam ser identificados. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades principalmente com a última etapa, a preparação da margem, porque requer habilidades manuais, tempo e dedicação. A demonstração visual é, portanto, fundamental para entender como uma emulsão adequada deve ser preparada.

A implicação dessa técnica se estende além do campo da autoimunidade. Saber preparar o antígeno in para imunização também pode ser usado para a produção de anticorpos monoclonais ou para testar novas vacinas. Demonstrando essa técnica estarão S Zoo heróico Ura e Mayland al gato do meu laboratório.

A hipófise do camundongo é uma glândula cilíndrica que fica na base do crânio em uma depressão do osso esfenóide chamada térica. A glândula é delimitada lateralmente pelos nervos trigêmeos e anteriormente pelo quiasma do nervo óptico. É composto por um lobo anterior maior e lobos menores, intermediários e posteriores.

Para isolar a glândula pituitária, use uma tesoura para decapitar o camundongo sacrificado e, em seguida, faça cortes paralelos da parte de trás para a frente do crânio. Levante o cérebro e vire-o para trás para expor a glândula pituitária, que aparece como um cilindro no contexto de um triângulo isósceles. Tendo a glândula pituitária como base, os nervos trigêmeos como lados e o quiasma óptico como vértice.

Circule a glândula com as pontas da pinça fechada para quebrar a meninga circundante. Em seguida, usando uma pinça fina, pegue a hipófise da cela de Turca e coloque-a em um tubo de plástico sobre gelo seco. Para uma preparação, colete 300 glândulas pituitárias de camundongos.

Esta coleta requer aproximadamente nove horas de pessoa. Assim que a coleta for concluída, armazene as glândulas pituitárias a menos 80 graus Celsius até que sejam necessárias. Coloque um tubo Falcon de 15 mililitros em um banho de gelo.

Adicione ao tubo 250 microlitros de tampão de homogeneização. Para cada 100 hipófises coletadas pouco antes da homogeneização, adicione as glândulas pituitárias de camundongo ao tampão. Em seguida, coloque a ponta do homogeneizador poly tron, um gerador de cinco milímetros de diâmetro na parte inferior do tubo Falcon contendo as hipófises do camundongo e homogeneize o tampão na velocidade máxima por 30 segundos.

Movendo suavemente o tubo para cima e para baixo, mantendo-o no gelo. Em seguida, coloque o homogeneizado no gelo por um minuto. Repita as etapas de homogeneização e resfriamento mais duas vezes.

Essa homogeneização suave deve quebrar as células e liberar as proteínas sem quebrar os núcleos Centrífuga. O homogeneizado em baixa velocidade, cerca de 1000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius para sedimentar, os núcleos, tecido intacto e materiais insolúveis, como tecido conjuntivo e complexos de proteínas desnaturados. Tomando cuidado para não perturbar o pellet.

Transfira o SNA agora chamado de estado pós-nuclear ou PNS para um novo armazenamento de tubos Falcon. O PNS no gelo retrai o pellet usando o mesmo volume de tampão de homogeneização de antes, homogeneizar e centrifugar como antes. Depois de agrupar as duas amostras de PNS, eloqua a solução em vários tubos de microcentrífuga.

Armazene os tubos da microcentrífuga a menos 80 graus Celsius até que sejam necessários. Esta preparação de proteína é estável a 80 graus Celsius negativos, mas perde gradualmente sua potência. Assim, recomenda-se usá-lo dentro de seis meses a partir do preparo.

Conservar uma pequena alíquota de PNS para determinar o rendimento e a concentração de proteínas pelo ensaio de ácido biy. Em seguida, determine a qualidade da proteína por eletroforese em gel de 300 glândulas pituitárias de camundongos, que têm um peso total médio de aproximadamente 570 miligramas. Espere um rendimento de 60 miligramas de proteínas hipofisárias ou um miligrama de proteína para cada 10 miligramas de tecido.

A concentração de proteína é tipicamente em torno de 40 miligramas por mililitro. O exemplo fornecido aqui é para imunizar 10 camundongos. Planeje injetar em cada camundongo 100 microlitros de emulsão contendo um miligrama de proteína hipofisária, permitindo que dois camundongos extras sofram perdas de material durante a preparação aqui, 12 miligramas de emulsão de proteína são preparados.

Comece descongelando rapidamente as alíquotas de proteína congeladas, aquecendo-as em suas mãos. Ajuste a concentração de proteína para 20 miligramas por mililitro com PBS. Em seguida, retire 600 microlitros do extrato de proteína hipofisária correspondente a 12 miligramas em uma seringa Gas Tite Hamilton de 2,5 mililitros ressuspendida, adjuvante FRONS completo ou CFA contendo cinco miligramas por mililitro de calor matou mycobacterium tuberculosis agitando-o manualmente.

Em seguida, coloque 600 microlitros do CFA em outra seringa Hamilton de 2,5 mililitros. Conecte e prenda uma agulha microemulsificante de calibre 22 à seringa cheia de CFA. Empurre lentamente o êmbolo de modo que a agulha fique cheia de CFA.

Em seguida, prenda e prenda a outra extremidade da agulha à outra seringa cheia de extrato de proteína hipofisária. Evite prender bolhas de ar dentro das seringas. Avance lentamente o êmbolo da seringa CFA para empurrar o componente de óleo para o extrato aquoso da hipófise, de modo que apenas uma pequena quantidade seja misturada.

Em seguida, empurre para trás o êmbolo da seringa de extrato hipofisário para a seringa CFA. Repita esta ação para aumentar gradualmente a quantidade de material misturado até que todo o conteúdo esteja misturado. Este material esbranquiçado e uniformemente distribuído representa a emulsão de água e óleo.

Uma vez que a emulsão é formada, repita o ciclo completo para frente e para trás pelo menos 500 vezes após o ciclo final, as seringas conterão uma emulsão de água e óleo um-para-um, onde a concentração de proteína hipofisária é agora de 10 miligramas por mililitro. A emulsão está pronta para ser usada para testar a qualidade da emulsão em uma gota dela para um copo de água. Se a emulsão for preparada corretamente, a gota permanecerá compacta e firme na superfície.

Se a emulsão for de baixa qualidade, ela se espalhará e se dividirá em gotas menores. A emulsão é injetada no mesmo dia de sua preparação em camundongos SJL para induzir hipofisite autoimune experimental. Este protocolo é detalhado no jo de acompanhamento da vertical.

Uma vez que a glândula pitu tenha sido coletada e as técnicas sejam dominadas, pode-se realizar a instrução da proteína em uma hora, lembrando-se de trabalhar rápido e no gelo. Durante esta etapa, Durante a preparação da imersão, que requer aproximadamente uma hora. Lembre-se de trabalhar devagar e pacientemente na fase inicial de mistura Após o seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da autoimunidade explorarem os mecanismos pelos quais os linfócitos autorreativos reconhecem e se infiltram no órgão-alvo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como preparar um extrato de proteína da glândula pituitária de camundongo e como misturá-lo com os aju de Crohn para preparar uma emulsão pronta para ser usada como imunógeno. Não se esqueça de que trabalhar com seringas e seringas completas para gripe, que contêm tuberculose microbacteriana inativada e seca, pode ser perigoso se você se perfurar acidentalmente.

Portanto, sempre use G glows e descarte as agulhas adequadamente ao realizar este procedimento.