Name: Preparação de rato Imunogénio Pituitária para a indução de hipofisite Auto-Imune Experimental (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprenda a preparar proteínas da glândula pituitária de camundongos para estudar hipofisite autoimune experimental. Este protocolo reprodutível permite investigar mecanismos de doenças autoimunes em modelos animais.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder DK080351 para PC.

Protocolo Experimental O primeiro passo neste protocolo experimental é coletar um grande número de glândulas pituitária de rato. O segundo passo é homogeneizar as glândulas para preparar um extrato de proteína. A terceira etapa é para emulsionar estas proteínas com uma mistura de hidrocarbonetos. Passo 1: Recolha e armazenamento das glândulas pituitária de rato A glândula pituitária do mouse fica na base do crânio em uma depressão do osso esfenóide chamada sela túrcica, cercado lateralmente pelos nervos trigêmeo e anteriormente pelo quiasma óptico. A glândula é composta de um grande lobo anterior e menor lóbulos posterior e intermédio, e pesa em média 1,9 mg. Glândula pituitária são coletados de camundongos de linhagens mistas, sexos e idades, destinado a ser sacrificados pela facilidade de cuidado animal. Para isolar a glândula pituitária, o mouse é eutanásia, a pele acima do crânio dissecado, eo osso do crânio cortado com uma tesoura. O cérebro é levantada para expor a glândula pituitária, que é então isolado da dura-máter ao redor, escavou para fora do osso esfenóide e armazenadas em um tubo de plástico em gelo seco. Em geral, usamos 300 glândulas pituitária do mouse para uma preparação de proteínas, um número que pode ser recolhida por uma pessoa em nove horas. Depois que a coleção estiver completa, o tubo que contém as glândulas pituitária é armazenada a -80 ° C até que esteja pronto para a próxima etapa. Etapa 2. Extração de proteínas do mouse pituitária <ol><li> Adicione o tampão de homogeneização para um tubo Falcon de 15 ml (catálogo não 352.059) mantidos em um banho de gelo, com 250 mL de tampão para cada 100 glândulas pituitárias coletados. Use um buffer de força iônica semelhante à que é fisiologicamente presente no interior do citoplasma da célula (0,2 M) e de pH fisiológico (7,4). Nós usamos tampão fosfato (0,161 M, pH 7,4), complementado com um coquetel inibidor de protease (Sigma-Aldrich, o catálogo não-P8340 1 ml). </li><li> Adicione a glândula pituitária para o buffer antes da homogeneização, e em seguida, coloque o gerador (5 mm de diâmetro) do homogeneizador Polytron no fundo do tubo Falcon. Homogeneizar em rpm máxima por 30 segundos, movendo-se delicadamente o tubo Falcon cima e para baixo, mantendo-o em banho de gelo. Então, o resto homogeneizado em gelo por 1 min. Repita a homogeneização e resfriamento passos mais duas vezes. Esta homogeneização suave deve quebrar as células e liberação de proteínas citosólicas sem interromper os núcleos. </li><li> Para remover o tecido núcleos, ininterrupta e materiais insolúveis (como tecido conjuntivo e complexos de proteína desnaturada), centrifugar o homogeneizado a baixa velocidade (1000g) por 10 min a 4 ° C. </li><li> Transferir o sobrenadante (agora chamado de Post-Nuclear sobrenadante, PNS) para um tubo Falcon nova, tendo o cuidado de deixar o pellet intacta, e armazenar o PNS no gelo. </li><li> Ressuspender o sedimento em volume original de tampão de homogeneização (250 mL de tampão para cada 100 glândulas pituitárias coletados), homogeneizar como acima, centrífuga como acima, e depois combinar o PNS segundo com o primeiro. </li><li> Alíquota as duas amostras agrupadas PNS em tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para a próxima etapa. Esta preparação proteína podem ser armazenadas a -80 ° C, mas aos poucos perde sua potência, por isso recomendamos a usá-lo dentro de 6 meses a partir da preparação. Use uma pequena alíquota para determinar a produção de proteína e concentração pelo ensaio BCA (Pierce catálogo no. 23.225), ea qualidade da proteína por electroforese em gel. Em geral, obtém-se cerca de 60 mg de proteína de 300 hipófises de rato em 1,5 mL de tampão de homogeneização, a uma concentração em torno de 40 mg / mL. </li></ol> Etapa 3. Preparação da emulsão para a imunização <ol><li> Descongele rapidamente as alíquotas de proteína congelados necessário para a experiência e ajustar a concentração de proteína de 20 mg / mL. Este extrato de proteína será emulsificada com adjuvante Freund 01:01 completo (CFA, Sigma F-5881), contendo 5 mg / mL de calor matou Mycobacterium tuberculosis (Becton Dickinson, 231.141). Cada rato vai receber 1 mg de extrato de hipófise em 100 mL de emulsão. </li><li> O exemplo dado aqui é para imunizar 10 ratos, onde cada rato serão injetados com 100 mL da emulsão contendo 1 mg de proteínas pituitária. Permitir que dois ratos extra para perda de material durante a preparação, então use 12 mg de proteínas pituitária. Aspire mL 600 dos 20 extrato de proteína mg / mL pituitária descrever acima usando uma seringa de 2,5 ml Hamilton herméticos. Ressuspender o CFA por agitação, e aspiramos 600 mL de CFA em mais 2,5 mL seringa Hamilton. Anexar e garantir uma agulha de calibre 22 micro-emulsionantes para a seringa cheia com CFA. Empurre lentamente o êmbolo da seringa CFA de tal forma que a agulha é preenchido com CFA, em seguida, anexar e segura a outra extremidade doa agulha para a seringa cheia com extrato de pituitária. </li><li> Lentamente avançar o êmbolo da seringa CFA para empurrar o componente óleo no extrato de pituitária aquosa, de modo que apenas uma pequena quantidade é misto. Em seguida, empurre o êmbolo da seringa extrato de hipófise na seringa CFA. Repita esta acção gradualmente aumentando a quantidade de material misturado. Continue até que todo o conteúdo das duas seringas são misturados. Você vai obter uma solução esbranquiçadas e distribuídas uniformemente que representa a emulsão de água em óleo. </li><li> Uma vez que a emulsão é formada, repita o movimento de vai-e-vem, pelo menos, 500 vezes para garantir a emulsão é bem misturado. Após o ciclo final de mixagem, de 1:1 de água em óleo, emulsão está pronto para usar e contém uma concentração de proteína pituitária de 10 mg / mL. A emulsão será injetado no mesmo dia por via subcutânea em ratos anestesiados SJL, conforme detalhado no artigo JOVE companheiro. </li></ol>

<ol><li>Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).</li>
<li>Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-lymphocyte-associated+antigen-4+blockage+can+induce+autoimmune+hypophysitis+in+patients+with+metastatic+melanoma+and+renal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer.</a> J Immunother. 28, 593-598 (2005).</li>
<li>Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+Hypophysitis+of+SJL+mice%3A+Clinical+Insights+from+a+New+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model.</a> Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).</li>
<li>Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+hypophysitis+and+Hashimoto%27s+disease+in+a+woman%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman.</a> J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).</li>
<li>Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hypophysitis%3A+an+underestimated+disease+in+search+of+its+autoantigen%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s).</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Apesar do fato de que o primeiro paciente com hipofisite auto-imune foi relatada em 1962 4, a auto-antígenos patogênicos pituitária continuam a ser identificados 5. Modelos animais podem ser muito úteis para identificar esses auto-antígenos, auxiliando na descoberta de biomarcadores que são traduzíveis para o atendimento ao paciente. Este artigo tem demonstrado um procedimento simples para preparação de proteínas pituitária de uma forma que é adequada para induzir hipofisite auto-imunes em animais ...

<table><tbody><tr><td>Tubos Falcon de 15 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão de homogeneização</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cocktail de inibidores de protease</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador Polytron</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ensaio BCA</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Adjuvante completo de Freund&amp;rsquo;s (CFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-5881</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BD Biosciences</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>Seringa gastight de 2,5 mL da Hamilton</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulha microemulsificante de 22 gauge</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de rato imunogénio pituitária para a indução de hipofisite auto-imune experimental

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Hipofisite auto-imune é uma inflamação crônica da glândula pituitária causada ou acompanhada de auto-imunidade 1. Ela tem sido tradicionalmente considerada uma doença rara, mas relatórios tem aumentado significativamente nos últimos anos. Hipofisite, de fato, não raro se desenvolve como um &quot;efeito colateral&quot; em pacientes com câncer tratados com anticorpos que bloqueiam os receptores inibitórios expressa nos linfócitos T, como CTLA-4 2 e PD-1 receptores. Hipofisite auto-imune pode ser induzida experimentalmente pela injeção de ratos com proteínas pituitária misturado com um 3 adjuvante. Neste artigo de vídeo demonstramos como extrair proteínas de rato pituitária glândulas e como prepará-los de forma adequada para induzir hipofisite auto-imunes em camundongos SJL.

Hipofisite auto-imune pode ser reproduzido em ratos através da injeção de um extrato de proteínas do mouse pituitária.

Preparação de rato Imunogénio Pituitária para a indução de hipofisite Auto-Imune Experimental

A hipofisite autoimune é uma inflamação crônica da glândula pituitária causada ou acompanhada por autoimunidade1. Tradicionalmente, ela tem sido considerada uma ...

A hipofisite autoimune caracteriza-se pelo aumento do tamanho da glândula pituitária e por uma deficiência em um ou mais hormônios hipofisários. Os autoantígenos responsáveis permanecem desconhecidos. Aqui, demonstra-se um protocolo para o preparo de proteínas da glândula pituitária de camundongo para uso no estudo desta doença.Primeiramente, as glândulas pituitárias são isoladas de camundongos eutanasiados. As pituitárias são então homogenizadas para romper mecanicamente as células e liberar proteínas citosólicas. O homogenato é clarificado por centrifugação de baixa velocidade e avaliado quanto à quantidade por ensaio colorimétrico, BCA, e quanto à qualidade por eletroforese em gel de poliacrilamida.Por fim, o homogeneizado proteico aquoso é misturado com um adjuvante oleoso. Essa mistura é então injetada em camundongos para criar um modelo de camundongo que assemelha a hipofisite autoimune. Conforme mostrado no vídeo complementar, quatro técnicas foram descritas para induzir hipofisite em animais experimentais.A técnica apresentada neste artigo, que consiste na injeção de uma mistura de proteínas hipofisárias com adjuvante de gripe, é a mais antiga, remontando aos anos 1960. Out

preparation-mouse-pituitary-immunogen-for-induction-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo mostra como induzir hipofisite auto-imunes em camundongos SJL e como avaliar sua gravidade pela histopatologia.

Indução de hipofisite Auto-Imune Experimental em Ratos SJL

Este vídeo demonstra uma técnica de homogeneização eficiente para gerar uma emulsão antigénio-adjuvante para induzir encefalomielite autoimune experimental (EAE) num modelo murino. A emulsão contém um autoantígeno - glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) - na fase aquosa, cercada por uma fase oleosa contínua composta por uma bactéria patogênica inativada. A emulsão garante uma liberação sustentada de antígenos para uma resposta imune prolongada.

Preparando uma emulsão adjuvante de antígeno para induzir encefalomielite autoimune

O vídeo demonstra a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo injetando uma combinação de glicoproteínas de oligodendrócitos de mielina e Mycobacterium tuberculosis inativado. O modelo permite que os pesquisadores estudem os mecanismos da doença e testem intervenções terapêuticas.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Neste vídeo, um modelo de camundongo com esclerose múltipla é estabelecido usando encefalomielite autoimune experimental (EAE). O camundongo é injetado com uma emulsão contendo um peptídeo neuronal e um adjuvante, desencadeando uma resposta imune que ativa as células T autorreativas. Isso é seguido por uma injeção de toxina coqueluche (PTX) para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que as células T autorreativas se infiltrem no cérebro. Essa infiltração inicia uma...

O transplante de células-tronco / progenitoras neurais (NPCs) detém grandes promessas em neurologia regenerativa. A administração sistêmica de NPCs se transformou em baixo invasivo e muito eficaz terapeuticamente protocolo eficaz, para entregar as células-tronco no cérebro e na medula espinhal de roedores e primatas não-humanos que sofreram prejuízos inflamatória crônica experimental do sistema nervoso central.

Injeção sistêmica de células-tronco neurais / progenitoras em ratos com EAE crónica

Neste relato apresentamos um protocolo que permite ao investigador gerar um modelo de uveíte intraocular em camundongo. Mais comumente referido como uveíte autoimune experimental (EAU), este modelo estabelecido captura muitos aspectos da doença humana. Aqui, descreveremos como induzir e monitorar a progressão da doença usando várias leituras.

Uveíte Autoimune Experimental: Um Modelo de Rato Inflamatório Intraocular

O presente protocolo descreve a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo utilizando glicoproteína de oligodendrócitos de mielina e monitorando o processo da doença usando um sistema de pontuação clínica. Os sintomas experimentais relacionados à encefalomielite autoimune são analisados usando tomografia microcomputadorizada de fêmur de camundongo e teste de campo aberto para avaliar o processo da doença de forma abrangente.

Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental

Vários tipos de modelos animais de tireoidite de Hashimoto foram estabelecidos, assim como a tireoidite autoimune espontânea no camundongo NOD. Camundongos H-2h4 são um modelo simples e confiável para indução de HT. Este artigo descreve essa abordagem e avalia o processo patológico para uma melhor compreensão do modelo murino de TAA.

Geração de um modelo de tireoidite autoimune espontânea em camundongos

Para induzir encefalomielite autoimune experimental, um modelo animal de esclerose múltipla, os ratos são imunizados com uma emulsão de água em óleo contendo um autoantígeno e adjuvante completo de Freund. Embora existam vários protocolos para a preparação dessas emulsões, um protocolo de homogeneização rápido, simples e padronizado para a preparação de emulsões é apresentado aqui.

Um método de homogeneização rápido, simples e padronizado para preparar emulsões de antígenos/adjuvantes para induzir encefalomielite autoimune experimental

A encefalomielite autoimune experimental é um dos modelos murinos de esclerose múltipla mais utilizados. No protocolo atual, camundongos C57BL/6J de ambos os sexos são imunizados com peptídeo glicoproteico oligodendrócito de mielina, resultando principalmente em paresia ascendente da cauda e membros. Aqui discutimos o protocolo de indução e avaliação da EAE.

Modelagem da Esclerose Múltipla em Dois Sexos: Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG35-55

Aprenda a preparar proteínas da glândula pituitária de camundongos para estudar hipofisite autoimune experimental. Este protocolo reprodutível permite investigar mecanismos de doenças autoimunes em modelos animais.

Preparação de rato Imunogénio Pituitária para a indução de hipofisite Auto-Imune Experimental

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