Name: Indução de hipofisite Auto-Imune Experimental em Ratos SJL (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprenda a induzir hipofisite autoimune experimental em camundongos SJL usando imunógeno hipofisário e avaliação histopatológica. Este modelo reproduz características da doença humana para estudos de imunologia e neurociência.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder DK080351 para PC, e por uma oferta generosa do Terry e família Kristine Gore.

Protocolo Experimental Uma vez que o imunógeno pituitária está preparada (ver artigo companheiro), é administrado por via subcutânea em camundongos SJL (The Jackson Laboratories, estoque 000.686). Uma segunda injeção idêntico é repetido sete dias depois. Ratos são então usados ​​para coletar in vivo e post-mortem resultados. Etapa 1. A injecção subcutânea de imunógeno em camundongos SJL pituitária Ratos são os primeiros anestesiados pela injeção de 0,5 ml de 20 mg / ml 2,2,2 tribromoetanol (Avertin, TCI América, T-1420) por via intraperitoneal. Camundongos são injetados por via subcutânea com 100 l da emulsão pituitária que, conforme indicado no companheiro JOVE 2181 artigo, contém 1 mg de extrato de pituitária e 0,25 mg de adjuvante de Freund completo. A emulsão é injetado na região dorsal posterior da perna esquerda ((50 mL) e na região inguinal direita (50 mL). A emulsão pituitária é injetado novamente no dia 7 para os sites oposto (50 ul na região dorsal perna direita traseiras e 50 ul na região inguinal esquerda). Camundongos são monitorados diariamente durante os primeiros 3 dias e depois semanalmente até o dia do sacrifício, que normalmente é 28 dias após a primeira imunização. Etapa 2. Coleção de resultados no vivo: ensaios de Sangue O tecido mais utilizado para avaliar os resultados experimentais, enquanto os ratos ainda estão vivos é sangue. O sangue é rotineiramente elaborado 14 dias após a primeira imunização para medir os níveis séricos de anticorpos pituitária ou outros marcadores como as citocinas e quimiocinas. O sangue é coletado de ratos vivem como se segue. Ratos são realizadas de forma segura pela nuca do pescoço e parte de trás do maxilar está localizado. Uma vez que a parte de trás do maxilar está localizado, 4 mm são lancetas usadas para perfurar o feixe vascular submandibular. Após coletar o sangue, a pressão sobre o lugar sobre a área usando um algodão embebido em álcool para evitar um hematoma. Sangue coletado é centrifugado a 2.000 g por 20 minutos, e armazenadas a -80 ° C até sua utilização. Etapa 3. Coleção de post-mortem resultados: Pituitária histopatologia Ratos são tipicamente sacrificado 28 dias após a primeira imunização. A característica fundamental necessário para estabelecer o diagnóstico de HAE é a infiltração da glândula pituitária por hematopoiéticas células mononucleares. Os ratos são sacrificados, colocando-os em uma câmara de plástico selado que é perfundido com CO 2. Camundongos são mantidos na câmara para um total de 8 minutos. Após a eutanásia, a glândula pituitária é coletado como descrito no artigo do companheiro. A glândula pituitária doente aparece inchada e mais firmemente aderente à dura-máter ao redor. Pinças afiadas são usadas para soltar as meninges ao redor da hipófise. Uma vez que o move livremente pituitária no osso esfenóide, uma extremidade da glândula pituitária é apreendido com uma pinça e da glândula pituitária é cuidadosamente levantada. A glândula é então colocada em um tubo de microcentrífuga contendo 5 fixador de Beckstead. A glândula pituitária é fixo durante a noite, embrulhado em papel de lente, e colocado em uma fita cassete. As glândulas são então processadas utilizando o protocolo a seguir: <table border="1"><tbody><tr><td> Número da Estação </td><td> Reagente </td><td> Tempo em minutos </td><td> Temperatura (Celsius) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Álcool a 70% </td><td> 5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Álcool a 70% </td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Álcool a 95% </td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Álcool a 95% </td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Álcool 100% </td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> Álcool 100% </td><td> 7,5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Álcool 100% </td><td> 7,5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> xileno </td><td> 20 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> xileno </td><td> 20 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> xileno </td><td&gt; 20 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> parafina </td><td> 30 </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> parafina </td><td> 5 </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 13 </td><td> parafina </td><td> 5 </td><td> 58 </td></tr></tbody></table> Após o processamento, as glândulas pituitárias são embebidos em parafina, e pelo menos cinco seções não consecutivas (5 m de espessura) são cortadas a partir de cada glândula. Após a secção, as glândulas são corados com hematoxilina e eosina, e analisadas para quantificar a infiltração mononuclear. A seção com a infiltração mais grave é selecionado para marcar. A gravidade é marcado por base uma estimativa subjetiva do grau de substituição hipófise anterior ou destruição por células do sistema imunológico: grau 0, nenhuma doença; grau 1, 2% -20% envolvimento; grau 2, 20% -30%; grau 3, 30% -50%; grau 4, 50% -90%; grau 5, mais de 90%. Todas as seções são marcados por dois indivíduos cegos para a fonte das seções.

<ol><li>Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+Hypophysitis+of+SJL+mice%3A+Clinical+Insights+from+a+New+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model.</a> Endocrinology. , (2008).</li>
<li>Twarog, F. J., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+thyroid+autoantibodies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The production of thyroid autoantibodies in mice.</a> J Immunol. 101, 242-2450 (1968).</li>
<li>Patrick, J., Lindstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+response+to+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autoimmune response to acetylcholine receptor.</a> Science. 180, 871-872 (1973).</li>
<li>Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hypophysitis%3A+an+underestimated+disease+in+search+of+its+autoantigen%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s).</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).</li>
<li>Beckstead, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+preservation+of+fixation-sensitive+antigens+in+paraffin-embedded+tissues%3A+addendum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum.</a> J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).</li>
<li>Levine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+adenophypophysitis%3A+new+experimental+disease+of+the+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Allergic adenophypophysitis: new experimental disease of the pituitary gland.</a> Science. 158, 1190-1191 (1967).</li>
<li>Yoon, J. W., Choi, D. S., Liang, H. C., Baek, H. S., Ko, I. Y., Jun, H. S., Gillam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+an+organ-specific+autoimmune+disease%2C+lymphocytic+hypophysitis%2C+in+hamsters+by+recombinant+rubella+virus+glycoprotein+and+prevention+of+disease+by+neonatal+thymectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Induction of an organ-specific autoimmune disease, lymphocytic hypophysitis, in hamsters by recombinant rubella virus glycoprotein and prevention of disease by neonatal thymectomy.</a> Journal of Virology. 66, 1210-1214 (1992).</li>
<li>Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+the+ovine+pituitary+gland+is+associated+with+hypophysitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis.</a> J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).</li>
<li>Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenohypophysitis+in+rat+pituitary+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Adenohypophysitis in rat pituitary allografts.</a> Int J Exp Pathol. , (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Quatro técnicas têm sido relatadas para induzir hipofisite em animais experimentais. A técnica descrita neste artigo, que é a injeção de proteínas pituitária misturado com adjuvante Freund s, é o mais antigo, que remonta a 1967 6, e foi melhorado mais recentemente 1. Outras técnicas são a injeção de glicoproteínas do vírus da rubéola solúveis em 1992 7, a injeção estereotáxica de um adenovírus diretamente na glândula pituitária, em 2002 8, eo transplante de glândulas pituitári...

<table><tbody><tr><td>Camundongos SJL (The Jackson Laboratories)</td><td></td><td>estoque 000686</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribrom&amp;#8211;etanol (Avertin)</td><td>TCI America</td><td>T-1420</td><td></td></tr><tr><td>Fixador de Beckstead&amp;rsquo;s</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

indução de hipofisite auto-imune experimental em ratos sjl

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Hipofisite auto-imune pode ser reproduzida experimentalmente pela injeção de proteínas pituitária misturado com adjuvante em camundongos suscetíveis 1. Modelos de ratos nos permitem estudar a forma como se desenrolam as doenças, muitas vezes fornecendo uma boa réplica dos mesmos processos que ocorrem nos seres humanos. Para algumas doenças auto-imunes, como diabetes tipo 1A, existem modelos (o mouse NOD) que, espontaneamente, desenvolver uma doença semelhante à contraparte humana. Para muitas outras doenças auto-imunes, no entanto, o modelo precisa ser induzida experimentalmente. Uma abordagem comum a este respeito é injetar o mouse com um antígeno dominante derivado do órgão em estudo. Por exemplo, os investigadores interessados ​​em tireoidite auto-imune injetar camundongos com tireoglobulina 2, e os interessados ​​em miastenia gravis injetá-las com o receptor de acetilcolina 3. Se o autoantígeno para uma determinada doença auto-imune não é conhecido, os investigadores injetar um extrato de proteína bruta do órgão alvo da reação auto-imune. Para hipofisite auto-imunes, a auto-antígeno patogênicos (s) continuam a ser identificados 4, e, assim, uma preparação de proteína bruta pituitária é usado. Neste artigo de vídeo demonstramos como induzir hipofisite auto-imune experimental em camundongos SJL.

Este vídeo mostra como induzir hipofisite auto-imunes em camundongos SJL e como avaliar sua gravidade pela histopatologia.

Indução de hipofisite Auto-Imune Experimental em Ratos SJL

A hipofisite autoimune pode ser reproduzida experimentalmente através da injeção de proteínas hipofisárias misturadas com um adjuvante em camundongos suscetíveis1. Camundongos...

A hipofisite autoimune caracteriza-se pelo aumento do tamanho da glândula pituitária e por deficiência em um ou mais hormônios hipofisários. Os antígenos autoimunes responsáveis permanecem desconhecidos. Um vídeo complementar demonstra um protocolo para o preparo de um imunógeno de hipófise murina, que será utilizado aqui para criar um modelo murino semelhante à hipofisite linfocítica autoimune humana.O imunógeno hipofisário é injetado em uma linhagem de camundongos suscetível. Em seguida, a injeção é repetida sete dias depois e, após 14 dias, o sangue é coletado para estudos de biomarcadores. No dia 28, as glândulas hipófises são coletadas de camundongos sacrificados, seccionadas e coradas para determinar o grau de infiltração de leucócitos.A hipofisite autoimune é uma doença cada vez mais reconhecida, que pode ser difícil de distinguir de outras massas não produtoras de hormônios que surgem na sela túrcica. Embora a doença tenha sido descrita pela primeira vez há cerca de 50 anos, os autoantígenos reconhecidos pelo sistema imunológico do paciente na hipofisite autoimune permaneceram elusivos. Em 2008, publicamos o desenvolvimento de um modelo murino que reproduz fielmente a doença humana que foi projetada para imitar.Este modelo de camundongo pode ser utilizado para descobrir os autoantígenos hipofisários envolvidos e para aprender mais sobre a patogênese e as histórias naturais da hipofisite. O modelo baseia-se na injeção de proteínas hipofisárias de camundongo em uma linhagem suscetível, como a linhagem SJL. Essas proteínas precisam ser misturadas com um adjuvante potente para criar um ambiente inflamatório local que eventualmente induz o aparecimento de linfócitos autoreativos hipofisários.Primeiro nos linfonodos que drenam o local da injeção e, em seguida, na glândula pituitária. O modelo exige a injeção de quantidades relativamente grandes de proteínas pituitárias, um total de dois miligramas por camundongo. Isso sugere que o autoantígeno ou os autoantígenos estão presentes em quantidade mínima dentro da glândula da fertilidade. A injeção de uma emulsão adequadamente preparada é fundamental para a indução da doença, pois resulta na liberação lenta e contínua de proteínas pituitárias nos locais de injeção, apoiando, por fim, a geração e a ativação de linfócitos específicos para a pituitária.No vídeo complementar, é apresentado um método para o preparo do imunógeno de hipófise. Glândulas hipófises isoladas de camundongos eutanasiados são homogeneizadas e clarificadas por centrifugação de baixa velocidade. A mistura proteica é avaliada quanto à quantidade por ensaio colorimétrico, BCA, e quanto à qualidade por eletroforese em gel de poliacrilamida.O homogenato protéico aquoso é então misturado com um adjuvante oleoso contendo bacilos inativos de Mycobacterium tuberculosis para produzir a emulsão hipofisária. Após preparar a emulsão conforme demonstrado no vídeo complementar, remova a agulha microemulsificante da seringa de um mililitro e acople uma agulha de 25 graus. São necessários 100 microlitros da emulsão hipofisária para cada camundongo a ser injetado.Após anestesiar um camundongo com Everton, certifique-se de que não há resposta ao aperto no dedo do pé, então injete 50 microlitros da emulsão por via subcutânea na região dorsal traseira esquerda da pata. Certifique-se de que a ponta da agulha esteja completamente sob a pele e de que nenhuma emulsão vaze do local da injeção. Em seguida, injete 50 microlitros na região inguinal direita.Mais uma vez, certifique-se de que nada escorra. Observe que a emulsão é esbranquiçada e pode ser difícil de distinguir no contexto do fundo branco do pelo do camundongo SGL L após a injeção. Devolva o camundongo à sua gaiola e monitore sua recuperação.Monitore diariamente os camundongos injetados durante os três primeiros dias após a injeção para garantir que nenhum sofrimento extremo ocorra. O adjuvante é pró-inflamatório, pois contém Mycobacterium tuberculosis inativada. Bacilos no sétimo dia, repita a injeção nos lados anatômicos opostos.Injete 50 microlitros na região da pata traseira dorsal direita e 50 microlitros na região inguinal esquerda. Monitore o camundongo como anteriormente, pois os resultados experimentais serão avaliados após a ocorrência de uma resposta imune. O sangue é o tecido mais comumente utilizado para avaliar os resultados experimentais enquanto os camundongos ainda estão vivos.O sangue é rotineiramente coletado 14 dias após a primeira imunização para medir os níveis séricos de anticorpos pituitários ou outros marcadores como citocinas e quimiocinas. Para coletar sangue de um camundongo vivo, segure o animal firmemente pela nuca e localize a região posterior do maxilar. Uma vez identificado esse local, fure o feixe vascular submandibular com uma lanceta de quatro milímetros.O sangue começará a emergir da área perfurada. Colete seis gotas de sangue em um tubo de microcentrífuga. Limpe a área perfurada com um papel-toalha úmido para estancar o sangramento.Coloque os tubos de sangue em uma centrífuga e gire a 2000 G por 20 minutos. Essa centrifugação separa as células sanguíneas, que irão parar no pellet, do soro snat. Transfira o soro para um novo tubo de microcentrífuga.Armazene o soro a menos 80 graus Celsius até que seja necessário. Leva aproximadamente um mês para que os camundongos imunizados desenvolvam hipofisite autoimune completa. Portanto, os camundongos são tipicamente sacrificados 28 dias após a primeira imunização.Após cortar o crânio, levante o cérebro e vire-o para trás para expor a glândula pituitária. Uma glândula pituitária doente apresenta-se inchada e mais firmemente aderida às meninges circundantes. Mova a ponta de uma pinça fina ao redor da glândula pituitária para soltar as meninges.Uma vez que a hipófise se mova livremente sobre este osso fen, segure uma extremidade da glândula com pinça e levante-a cuidadosamente deste osso fen. Coloque o tecido em um tubo de microcentrífuga contendo um mililitro de solução betted, um fixador à base de zinco, e fixe a glândula durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, transfira a hipófise para um pedaço de papel de lente.Envolva a glândula pituitária no papel de filtro e coloque-a em um cassete de histologia. Processe a amostra incubando em concentrações crescentes de álcool e, posteriormente, xilol após o processamento. Remova o papel de filtro e coloque a pituitária em um molde metálico.Em seguida, cubra a hipófise com parafina. Coloque a cápsula de tecido sobre o molde e preencha-a com parafina adicional. Por fim, coloque o conjunto sobre gelo para permitir que a parafina solidifique.Uma vez que a parafina tenha solidificado, utilize um micrótomo para cortar seções com espessura de cinco mícrons. Recolha as seções em uma lâmina de vidro. Colete pelo menos cinco seções não consecutivas na mesma lâmina de cada glândula pituitária de camundongo.Colorir as lâminas com hematina e eosina utilizando uma estação automatizada de coloração tecidual. Examinar as lâminas com um microscópio óptico para coletar os resultados. A característica principal de uma glândula pituitária que desenvolveu hipofisite é sua infiltração por linfócitos, que aparecem como pequenas células azuis que percolam pelo parênquima pituitário isoladamente ou formando aglomerados.Os linfócitos estão associados a vários graus de destruição das células endócrinas normais da hipófise. A seção com a infiltração linfocítica mais grave e destruição da glândula hipofisária é escolhida para pontuação por dois investigadores cegos às condições experimentais. A pontuação baseia-se em uma estimativa subjetiva da extensão dos danos.Um escore de zero indica uma glândula pituitária normal ou que linfócitos e outras células mononucleares hematopoiéticas são raramente observados. Um escore de um indica que a infiltração mononuclear ocupa entre dois e 20% da área total da porção anterior da pituitária. Um escore de dois indica que a infiltração mononuclear ocupa entre 20 e 30% da área total da porção anterior da pituitária.Uma pontuação de três indica que a infiltração mononuclear ocupa entre 30 e 50% da área total da adeno-hipófise. Uma pontuação de quatro indica que a infiltração mononuclear ocupa entre 50 e 90% da área total da adeno-hipófise, e uma pontuação de cinco indica que a infiltração mononuclear ocupou quase toda a área da adeno-hipófise. Após dominar a técnica, a injeção do imunógeno em um camundongo pode ser realizada em 15 minutos.A coleta de sangue periférico de um camundongo pode ser realizada em cinco minutos e o preparo de lâminas para histopatologia em seis horas, enquanto se realiza o procedimento de imunização. É importante prestar muita atenção à saúde do camundongo após a anestesia e a injeção do imunógeno. Além disso, à histopatologia da hipófise.Este procedimento pode ser utilizado para coletar uma ampla variedade de resultados experimentais usando diversos métodos, como a avaliação das subpopulações de células inflamatórias nos linfonodos drenantes por citometria de fluxo. A técnica de imunização com um extrato tecidual para indução de uma doença autoimune abre caminho para que pesquisadores na área de autoimunidade descubram os eventos-chave na patogênese da doença. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como imunizar camundongos para induzir hipofisite autoimune experimental e de como avaliar sua incidência e gravidade.Não se esqueça de que trabalhar com lâminas de microtomia pode ser perigoso. Assim, precauções como o uso de luvas e o trabalho em boas condições de iluminação devem sempre ser tomadas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por CCR7-efetoras de memória T (TEM) linfócitos. Aqui demonstramos como ativar células antígeno-específicas TEM, induzir DTH adotivos em ratos Lewis e monitorar a resposta inflamatória.

Indução e Monitoramento de hipersensibilidade tardia-Type Adoptive em Ratos

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Preparação de rato Imunogénio Pituitária para a indução de hipofisite Auto-Imune Experimental

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Indução de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

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Aqui, relatamos um protocolo que estabelece um modelo de camundongo com artrite reumatóide (AR) por meio da transferência adotiva de células T CD4+ de camundongos SKG, fornecendo uma ferramenta experimental rápida e confiável para investigar os mecanismos imunológicos, progressão patológica e desenvolvimento de novos tratamentos para AR.

Um modelo de transferência adotiva de artrite reumatóide em camundongos

Aprenda a induzir hipofisite autoimune experimental em camundongos SJL usando imunógeno hipofisário e avaliação histopatológica. Este modelo reproduz características da doença humana para estudos de imunologia e neurociência.

Indução de hipofisite Auto-Imune Experimental em Ratos SJL

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