Name: Atividade de testes Protozoacidal Ligand-lítica Peptídeos Contra Gut Termite Protozoa In vitro (Cultura Protozoa) e In vivo (Microinjeção em Termite intestino grosso) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-29T17:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 36 s
Description: Aprenda a testar a atividade protozoicida de peptídeos líticos ligados contra protozoários do intestino de cupins, utilizando cultura in vitro e microinjeção in vivo. Este método auxilia no desenvolvimento de estratégias inovadoras de controle de pragas.

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Agradecemos ao Dr. Allison Richard, ex-diretor da unidade peptídeo LSU para a síntese do ligante fluorescentes, o Centro de Pesquisa Interdisciplinaray Biotecnologia, UF para a síntese de peptídeos ligante-líticas, ea instalação de Microscópio Socolovsky para fornecer acesso a microscópios de fluorescência. O financiamento foi fornecido pelo Programa de Desenvolvimento SERDP exploratória (SEED) do Departamento de Defesa, Departamento de Energia e Agência de Proteção Ambiental, a Biotecnologia AgCenter Programa Equipe Interdisciplinar eo estado de Louisiana.

Experimento 1: Extração de intestino de cupins protozoários em condições anaeróbias <ol><li> Use uma caixa de ventilador (Laboratories Coy) em uma caixa de luva constantemente circular o ar através de um dessecante e D catalisador tipo Stak-Paks para controle de umidade e níveis de oxigênio e eliminar a temperaturas irregulares. Preencher o porta-luvas com um fluxo contínuo de nitrogênio por 20 a 30 min. Monitorar os níveis de oxigênio com um sensor de oxigênio (C-quadrado, Inc.) para 1 h. Uso de nitrogênio para alcançar e manter condições anaeróbicas, quando necessário. </li><li> Prepare Trager U media (Trager 1934) e ajustar o pH para 7,0. Sparge o meio filtrante esterilizada no porta-luvas com uma mistura de hidrogênio 2,5%, de dióxido de carbono de 5% e 92,5% de nitrogênio por 1 h para remover os resíduos de oxigênio. </li><li> Silanizadas todos os materiais, incluindo lâminas de microscópio, tubos de microcentrífuga, pipetas, copos etc utilizados nos experimentos usando Sigmacote para evitar a adsorção de protozoários ou peptídeos em superfícies (Sigmacote, Sigma, # SL-2, http://www.sigmaaldrich.com/ etc / medialib / docs / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf). </li><li> Desde intestino de cupins protozoários são organismos estritamente anaeróbios que não deve ser exposto ao oxigênio. Portanto, as seguintes etapas são realizadas sob condições anaeróbicas em uma caixa de luva (ver 1.1). Com uma pinça de submergir todo o corpo de um trabalhador de cupins em etanol 70% e rode suavemente por cerca de 10 s para remover os contaminantes de superfície. </li><li> Remover o trabalhador a partir do etanol e deixe secar em um Kimwipe limpa para cerca de 20 s. Use uma solução estéril de ponta fina pinça para segurar o trabalhador abdômen e agarra a ponta do abdômen com um par de pinças para puxar suavemente o intestino cima ou para baixo em um ângulo de 45 graus. Se o intestino é puxado em um ângulo reto e com muita força, é provável que quebre. Coloque 10 guts em uma queda de 100 l media Trager U em uma lâmina de microscópio. </li><li> Pierce as entranhas com um par de sondas estéreis fina dissecação para liberar os protozoários e gentilmente transferir o conteúdo do intestino com uma pipeta de 200 mL em um tubo de microcentrífuga de 1 ml contendo 900 mL Trager U mídia. Depois de permitir a sedimentação dos fragmentos de parede do intestino (5 s), 900 mL de transferência do sobrenadante para um novo tubo. </li><li> Transferência de 10 ml de cultura de protozoários para uma lâmina de microscópio sigmacoted e verificar a condição de protozoários ao microscópio com 200 X de ampliação. </li><li> Prepare culturas controle do pyriformis Tetrahymena aeróbica protozoários, Amoeba sp., Euglena sp. E Paramecium sp. (Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC), bem como uma cultura overnight de Escherichia coli nos meios de cultura recomendados pelo fornecedor. </li></ol> Experimento 2: Adicionar ligante acoplado com um corante fluorescente para os protozoários e as bactérias culturas para testar para a ligação com as membranas de superfície e paredes celulares Nós usamos anteriormente bibliotecas phage display (New England Biolabs Inc, Ipswich, MA) para identificar seqüências de 19 heptapéptido que se ligam a protozoários (protocolos disponíveis em http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf). Um ligante com uma seqüência de peptídeos (ALNLTLH) que mostrava semelhanças com glicoproteínas putativa conhecida da membrana Trypanosoma brucei foi sintetizado e acoplado a um C-terminal fluorescentes sonda (EDANS, 5 - ((2-aminoetil) amino) naftaleno-1-sulfônico ácido, λmax = 341 nm, λem = 471 nm) através de síntese de estado sólido peptídeo (SSPS), utilizando o EDANS resina NovaTag (EMD Biosciences). Aqui demonstramos que o ligante se liga ao protozoários que foram isoladas do intestino de cupins e outros protozoários de vida livre, mas não para bactérias. <ol><li> Cultura do protozoário, como descrito no experimento. 1. Fix protozoários com formol a 10% a 4 ° C por 12 h. </li><li> Centrifugar a solução protozoários (30 xg, 10 min), desprezar o sobrenadante e lavar o pellet contendo os protozoários fixos duas vezes em 1ml Trager U mídia. Re-suspender o sedimento em 1 ml Trager U mídia. Além disso, corrigir outros protozoários, e E. bactéria Escherichia para controles. </li><li> Incubar os microrganismos fixos por 1-2 h com solução de ligante sintetizado acoplado ao EDANS corante fluorescente (preparada em água) a uma concentração final de 50 mM. O ligante se dissolve melhor na água do que Trager U mídia. </li><li> Observe os microorganismos sob um microscópio de fluorescência em 400 X ampliação em um máximo de absorbância a 341 nm e uma emissão na região azul em 471 nm. </li></ol> Experimento 3: Teste de atividade protozoacidal do ligante acoplado a um peptídeo lítico in vitro (cultura de protozoários) A conjugada do ligante e do peptídeo lítico Hecate (Mutwiri et al. 2000) foi previamente sintetizado no Centro de Proteína LSU. <ol><li> Silanizadas materiais e preparar a cultura cupim gut protozoários no porta-luvas uma anaeróbias descritos no Exp. 1. </li><li> Prepare culturas de microrganismos aeróbios de controle (por exemplo, E. coli e as espécies de vida livre protozoário T. pyriformis). </li><li> No ambiente anaeróbio do porta-luvas, pipeta seis alíquotas de 198 mL de cultura de protozoários em tubos de 0,5 ml Eppendorf. Adicione 2 mL de uma solução de M-100 de ligante peptídeo lítico a metade das alíquotas (concentração de 1 mM final) da cultura do intestino de cupins protozoários. Adicione 2 mL de água para a outra metade das alíquotas (controles). </li><li> Na bancada, prepare alíquotas semelhantes de E. coli e T. pyriformis com um peptídeo lítico peptídeo M, ligando-líticas ou água. </li><li> Após 1 h, a transferência de 10 ml de cada cultura protozoários aos slides. Compare a sobrevivência dos protozoários tratados ao de controles em um microscópio com 200 X de ampliação. </li><li> Após 1 h, 100 mL placa de aprox. 10 -4 diluição do E. culturas coli em BHI e incubar a 37 ° C durante a noite. Compare o número de unidades formadoras de colônias nas placas. </li></ol> Experiência 4: Injeção do ligante acoplado a um corante fluorescente no intestino posterior para o cupim <ol><li> Puxar agulhas (Modelo GD-1, 1 X 900 mm) usando um PC-10 Narishige vidro extrator micropipeta com um nível de dupla fase de calor (65 e 48) para obter um tamanho da ponta de 20-30 mM. Confirmar o tamanho da ponta, medindo-lo sob um microscópio utilizando um micrômetro. </li><li> Preencher uma agulha com ca. 30 mL de 50 mM de ligante fluorescente marcados em suspensão na água usando uma seringa anexado. Encha uma outra agulha com água para o controle. Anexar uma micropipeta (0,5 mL de capacidade e 32 mm de comprimento, Drummond Companhia Científica) a um detentor de um micromanipulador. Coloque uma agulha para o titular sistema de injeção em um micromanipulador segundo. Definir os parâmetros de injeção inicial de cerca de 1 comprimento do pulso e 10-12 s injeção psi. Antecedência a agulha lentamente na micropipeta e injetar a solução com um pedal-driven de alta velocidade do sistema de injeção eletrônica com um controle comprimento de pulso ligado a um fluxo controlado de gás nitrogênio, o que garante que um volume constante é reproduzível injetado. Após a injeção, remova a micropipeta e gravar o comprimento da solução injetada usando um paquímetro Vernier. Calcular o volume injetado a partir dos parâmetros conhecidos da micropipeta. Ajustar a pressão de gás nitrogênio e do comprimento de pulso para expulsar 0,3 mL de solução em uma única injeção. </li><li> Aperte o fim de um abdômen trabalhador cupins com uma pinça macio para remover qualquer presente excreta no reto. Imobilizar trabalhador cupins pelo frio-los no gelo por 5 min. </li><li> Faça receptores para a realização de trabalhadores de cupins, cortando 100 ponteiras mL usando uma lâmina de bisturi. Cortar a ponta para um comprimento de 10-12 mm e usar de acordo com o tamanho de cupins. </li><li> Anexar o receptor para o micromanipulador. Coloque um trabalhador em uma placa de Petri de lado dorsal e aspire a cabeça primeiro trabalhador para o receptor usando uma bomba de sucção de azoto de modo que o término do trabalhador se projeta a partir do receptor. </li><li> Segurando o cupim no receptor, cuidadosamente antecedência a agulha cheia usando o micromanipulador para inseri-lo no ânus trabalhador. Injetar 0,3 mL da solução (ligante fluorescente marcado ou água para controles). </li><li> Colocam os trabalhadores injetados com ligante ou água em pratos separados petri com papel de filtro úmido e mantê-los em 26 ± 2 ° C com 78% RH </li><li> Extirpar entranhas da cupins injetado e recolher os protozoários após 24 h, como mostrado acima na Exp. 1. Fix e observar os protozoários, como mostrado na Exp. 2. </li></ol> Experiência 5: Teste de atividade protozoacidal do ligante acoplado a um peptídeo lítico in vivo (injecção de cupins hindgut) <ol><li> Silanizadas materiais, conforme descrito no experimento. 1. </li><li> Prepare uma solução M 500 do peptídeo ligante-lítica na água. </li><li> Siga os passos 3.1) através de 3.4) para preparar as agulhas de vidro, os receptores e os trabalhadores de cupins. </li><li> Seguindo os métodos descritos em 3.5) injetar 0,3 mL de solução de ligante-lítica de peptídeos (tratamento) ou água (controle) no intestino posterior de 20 trabalhadores de cupins. </li><li> Segure cupins por 24 h, coragem extirpar de vários trabalhadores e observar conteúdo estomacal sob o microscópio, como descrito em 3.6). e 3.7). </li><li> Assim a morte de protozoários no intestino de cupins é confirmado, manter restantes cupins tratados e controles em placas de Petri com papel de filtro úmido e observar mortalidade diária. </li></ol> Resultados representativos: Experimento 1: Normalmente, intestino anterior, intestino médio e intestino posterior são obtidas numa só peça, quando o procedimento é seguido corretamente (Figura 1a). Os protozoários residem em alta densidade nas porções anaeróbia do intestino grosso e pode ser liberado pela perfuração do intestino grosso com uma pinça (Figura 1b 1 e 2). O maior protoespécies zoa no intestino do cupim subterrâneo Formosan é o P. fusiformes grassii, que é de 200-300 mM de comprimento e 150 m de largura e pode ser visto a olho nu. A espécie é a segunda maior H. pear-shaped hartmanni (50-140 mM de comprimento e 30-80 m de largura). A menor espécie é o S. em forma de cone leidyi (15-50 mM de comprimento e 30/08 m de largura;. Lai et al 1983). As espécies de protozoários são mostrados na Figura 2. Sob condições de cultivo ideal das três espécies de protozoários isolada do intestino de cupins subterrâneos Formosa permanecerão vivos e saudáveis ​​por pelo menos 72 h em media U Trager anaeróbia (Figura 3a). No entanto, se as condições de cultura não são ideais protozoários vai morrer rápido. Se houver resíduos de oxigênio na mídia, o movimento de protozoários cessará imediatamente. Se a pressão osmótica é muito alta ou a integridade da membrana fica comprometida a membrana da superfície da protuberância vai para fora e protozoários a ruptura de células (Figura 3b). Se a pressão osmótica é muito baixo ou membranas são comprometidos, protozoários irá murchar e encolher (Figura 3c). Experimento 2: Nós confirmamos que o ligante acoplado a uma sonda fluorescente ligado a todas as três espécies de protozoários do intestino posterior de Formosan cupins subterrâneos em densidades detectável. Ligação do ligante ocorre na superfície de células inteiras (Figura 4). Sítios de ligação estão concentradas na região anterior do protozoário no axostyle (uma folha de microtúbulos) e núcleo em P. grassii. Observamos alguns autofluorescência irregular de partículas de madeira ingerida pelo protozoário. No entanto, autofluorescência é geralmente fácil de discernir de ligação específica do ligante, uma vez que não há autofluorescência da superfície, o axostyle eo núcleo (Figura 4). Nós também detectada fluorescência em todas as testadas de vida livre aeróbica espécies de protozoários (Figura 5), ​​o que sugere que o ligante se liga a estruturas genéricas para protozoários. No entanto, nenhuma ligação do ligante foi observado para E. coli. Experimento 3: Um mM de ligante-lítica de peptídeos matou todos os três espécies de protozoários do intestino de cupins de Formosa trabalhadores subterrâneos e T. de vida livre pyriformis in vitro em menos de 10 min, enquanto os controles permaneceram vivos. A Figura 6 mostra a perda progressiva da integridade da membrana do intestino de cupins protozoários tratados com ligante-lítica de peptídeos. Membranas bojo e ruptura, shrivel protozoários e morrer. Não foi observada diferença no número de E. colônias coli entre os tratamentos do ligante-lítica de peptídeos e água. Peptídeo lítico sem ligante, entretanto, reduziu o número de E. colônias coli consideravelmente (Figura 7). Isto sugere que a fixação do ligante, em certa medida protege os microorganismos não-alvo de lise. Experiência 4: 0,3 mL Quando 50 mM do ligante marcado fluorescente foi injetado no intestino posterior dos trabalhadores de cupins, a ligação a P. grassii, S. leidyi e H. hartmanni foi confirmado através de microscopia de fluorescência semelhante ao Exp. 2 (Figura 4). Cupim tecido intestinal não mostrou fluorescência. Experiência 5: A injeção de 0,3 mL 500 mM ligante-lítica de peptídeos matou todas as três espécies de protozoários no intestino de cupins subterrâneos Formosan dentro de 24h. Cupins morreram dentro de 10 dias após a perda de seus protozoários simbióticos. Anteriormente, Husseneder e Collier (2009) injetaram a mesma concentração de peptídeo lítico em tripas de cupins. Sem o ligante ligado, demorou mais tempo até que os protozoários no intestino (72 h) e os cupins foram mortos (seis semanas). Isto sugere que o ligante aumenta a eficiência protozoacidal de peptídeos lítico, muito provavelmente pela ligação dos peptídeos líticas para o protozoário. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. a: Formosa do intestino de cupins subterrâneos em um slide mostrando as principais seções do intestino (frente, médio, intestino grosso); b 1 e 2: intestino posterior é perfurada com uma pinça para liberar o conteúdo do intestino contendo os protozoários. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. As três espécies de protozoários flagelados encontrados no intestino posterior do cupim subterrâneo Formosan: a) Pseudotrichonympha grassii, b) Holomastigotoides hartmanni, e c) Spirotrichonympha leidyi. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Protozoários na cultura, uma saudável) protozoários, b) Protozoa com membranas abaulamento, c) encolhidas protozoários. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Confirmação da ligação do ligante acoplado a uma sonda fluorescente para cupim gutprotozoários (de cima para baixo: P. grassii, H. hartmanni, S. Leydi), tratados com ligante fluorescente marcado e controles não tratados (mostrando autofluorescência). <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Ligação do ligando a protozoários de vida livre aeróbica, a) Tetrahymena, b) Amoeba, c) Euglena, e d) Paramecium. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Tratamento de protozoários com água) (controle) e b) 1 mM ligante-lítica de peptídeos. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. E. colônias coli em placas (10 diluição -4): a) tratados com água (controle), b) tratados com 1 mM ligante-lítica de peptídeos, c) tratados com 1 mM peptídeo lítico.

<ol><li>Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugates+of+lytic+peptides+and+LHRH+or+%CE%B2CG+target+and+cause+necrosis+of+prostate+cancers+and+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Conjugates of lytic peptides and LHRH or βCG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).</li>
<li>Husseneder, C., Collier, R. E. Paratransgenesis for termite control. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHusseneder%2C+C+%22Insect+Symbiosis%22">Insect Symbiosis</a>. Bourtzis, K., Miller, T. A. 3, CRC Press LLC. Boca Raton, Florida. Volume 3 361-376 (2009).</li>
<li>Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+genetically+engineered+bacteria+%28Escherichia+coli%29+to+monitor+ingestion%2C+loss+and+transfer+of+bacteria+in+termites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites.</a> Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).</li>
<li>Husseneder, C., Grace, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+termite+gut+bacteria+deliver+and+spread+foreign+genes+in+termite+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered termite gut bacteria deliver and spread foreign genes in termite colonies.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 360-367 (2005).</li>
<li>Javadpour, M. M., Juban, M. M., Lo, W. C., Bishop, S. M., Alberty, J. B., Cowell, S. M., Becker, C. L., Mc Laughlin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+antimicrobial+peptides+with+low+mammalian+cell+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity.</a> J. Med. Chem. 39, 3107-3113 (1996).</li>
<li>Lai, P. Y., Tamashiro, M., Fuji, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+and+distribution+of+the+three+species+of+symbiotic+protozoa+in+the+hindgut+of+Coptotermes+formosanus+%28Isoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Haw.+Entomol.+Soc%22%5BJournal%5D)">Abundance and distribution of the three species of symbiotic protozoa in the hindgut of Coptotermes formosanus (Isoptera).</a> Proc. Haw. Entomol. Soc. 24, 271-276 (1983).</li>
<li>Leuschner, C., Hansel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+disrupting+lytic+peptides+for+cancer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Membrane disrupting lytic peptides for cancer treatments.</a> Curr. Pharm. Des. 10, 2299-2310 (2004).</li>
<li>Mutwiri, G. K., Henk, W. G., Enright, F. M., Corbeil, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+Antimicrobial+Peptide%2C+d-Hecate%2C+on+Trichomonads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Effect of the Antimicrobial Peptide, d-Hecate, on Trichomonads.</a> J. Parasitol. 86, 1355-1359 (2000).</li>
<li>Trager, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cultivation+of+a+cellulose-digesting+flagellate%2C+Trichomonas+termopsidis%2C+and+of+certain+other+termite+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">The cultivation of a cellulose-digesting flagellate, Trichomonas termopsidis, and of certain other termite protozoa.</a> Biol. Bull. 66, 182-190 (1934).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Ligante-lítica de peptídeos têm sido usados ​​com sucesso para efetivamente atacar e destruir as células cancerosas (Hansel e Leuschner 2004, Hansel et al. 2007). Com base neste conceito, foi desenvolvido um ligante heptapéptido que se liga à superfície de protozoários no intestino de cupins subterrâneos Formosan e acoplado a um peptídeo lítico com o objetivo de destruir estes obrigam-celulose digerir simbiontes no intestino de cupins para alcançar cupins controle (Husseneder e Collier 2009). <p class="jove...

<table><tbody><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL-2</td><td></td></tr><tr><td>EDANS</td><td>Novabiochem, EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caixa de luvas anaeróbica</td><td>Coy Laboratories, Inc.</td><td>Feita sob encomenda</td><td></td></tr><tr><td>Controlador ambiental Intellus</td><td>Percival Scientific, Inc.</td><td>I36NL</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de micropipetas de vidro PC-10</td><td>Narishige International</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de vidro (Modelo GD-1, 1 X 900 mm)</td><td>Narishige International</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipuladores Leitz</td><td>Vermont Optechs, Inc.</td><td>ACS01</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Microcaps</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-0005</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem de fluorescência LEICA</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMRxA2</td><td></td></tr><tr><td>Lupa estereoscópica LEICA</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio LEICA</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMLB</td><td></td></tr><tr><td>Lupa estereoscópica Olympus</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ61</td><td></td></tr></tbody></table>

atividade de testes protozoacidal ligand-lítica peptídeos contra gut termite protozoa in vitro (cultura protozoa) e in vivo (microinjeção em termite intestino grosso)

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro (Protozoa Culture) and in vivo (Microinjection into Termite Hindgut)

Estamos desenvolvendo uma nova abordagem para controle de cupins subterrâneos que levam a dependência reduzida sobre o uso de pesticidas químicos. Cupins subterrâneos são dependentes de protozoários do hindguts de trabalhadores de forma eficiente digerir madeira. Peptídeos líticas têm sido mostrados para matar uma variedade de protozoários parasitas (Mutwiri et al. 2000) e também protozoários no intestino do cupim subterrâneo Formosan, Coptotermes formosanus (Husseneder e Collier 2009). Líticas peptídeos são parte do sistema imune inespecífica dos eucariotos, e destruir as membranas de microrganismos (Leuschner e Hansel, 2004). Peptídeos mais lítica não são susceptíveis de prejudicar eucariotos superiores, porque eles não afetam o eletricamente neutro membranas contendo colesterol das células de eucariotos superiores (Javadpour et al. 1996). Ação peptídeo lítico pode ser direcionada para tipos específicos de células pela adição de um ligante. Por exemplo, Hansel et al. (2007) relataram que os peptídeos líticas conjugado com câncer de células ligantes do receptor de membrana pode ser usada para destruir as células do câncer de mama, enquanto peptídeos líticas isoladamente ou conjugados com os não-específicas peptídeos não foram eficazes. Líticas peptídeos também foram conjugados aos hormônios humanos que se ligam a receptores nas células tumorais para a destruição específica de células cancerosas da próstata e testicular (Leuschner e Hansel, 2004). Neste artigo apresentamos as técnicas utilizadas para demonstrar a atividade protozoacidal de um peptídeo lítico (Hecate) acoplado a um ligante que se liga a heptapéptido a membrana de superfície de protozoários no intestino do cupim subterrâneo Formosan. Essas técnicas incluem a extirpação do intestino de cupins trabalhadores, a cultura anaeróbica de intestino protozoários (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni, Spirotrichonympha leidyi), a confirmação microscópica que o ligante marcadas com um corante fluorescente se liga ao intestino de cupins protozoários e outros protozoários de vida livre, mas não a bactérias ou tecido do intestino. Nós também demonstramos que o ligante mesmo acoplado a um peptídeo lítico eficiente mata intestino de cupins protozoários in vitro (cultura de protozoários) e in vivo (microinjeção no intestino posterior dos trabalhadores), mas é menos do que o bactericida peptídeo lítico sozinho. A perda de protozoários leva à morte dos cupins em menos de duas semanas. No futuro, iremos modificar geneticamente microorganismos que podem sobreviver no intestino posterior de cupins e espalhar através de uma colônia de cupins como &quot;Cavalos de Tróia&quot; para expressar-ligante líticas peptídeos que mataria o protozoário no intestino de cupins e, posteriormente, matar os cupins na colônia . Ligante-lítica peptídeos também podem ser úteis para o desenvolvimento de medicamentos contra parasitas protozoários.

Apresentamos os procedimentos para demonstrar que ligantes se ligam à superfície da membrana de celulose de digestão destes protozoários no intestino de cupins subterrâneos Formosan por microscopia de fluorescência e que juntamente com peptídeos ligantes líticas matar protozoários<em&gt; In vitro</em&gt; (Cultura protozoários anaeróbios) e<em&gt; In vivo</em&gt; (Injecção no intestino posterior de cupins).

Atividade de testes Protozoacidal Ligand-lítica Peptídeos Contra Gut Termite Protozoa In vitro (Cultura Protozoa) e In vivo (Microinjeção em Termite intestino grosso)

Estamos desenvolvendo uma nova abordagem para o controle de cupins subterrâneos que levaria a uma redução da dependência do uso de pesticidas químicos. Cupins subterrâneos...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar que um ligante sintetizado se liga especificamente aos protozoários digestores de celulose no intestino de térmitas subterrâneas do gênero *form mosen*, e que o ligante conjugado com um peptídeo lítico mata esses protozoários *in vitro* em culturas anaeróbicas de protozoários e *in vivo* por injeção no intestino posterior do termite. Isso é realizado primeiramente pela extração de protozoários do intestino de térmitas operárias sob condições anaeróbicas. O segundo passo do procedimento é confirmar a ligação de um ligante conjugado com um fluoróforo aos protozoários do intestino de térmitas *in vitro*.O terceiro passo do procedimento consiste em demonstrar que o peptídeo lítico conjugado ao ligante mata os protozoários do intestino de cupim in vitro. O passo final do procedimento é injetar o ligante conjugado a um fluoróforo e o peptídeo lítico conjugado ao ligante no intestino posterior do cupim para confirmar a ligação e a destruição dos protozoários intestinais in vivo. Utilizando injeções de culturas de protozoários no intestino posterior do cupim e microscopia de fluorescência, demonstramos que um ligante conjugado a um peptídeo lítico se liga e mata eficientemente os protozoários do intestino de cupim in vitro e in vivo.A ligação do ligante ao peptídeo lítico aumentou a toxicidade para protozoários em comparação com o peptídeo lítico isolado. Embora tenha reduzido a toxicidade para organismos não alvo, como *E. coli*, muito provavelmente porque o ligante não se ligou à membrana celular bacteriana, a perda de protozoários leva à morte dos cupins em menos de duas semanas. A técnica apresentada, que utiliza peptídeos colíticos com ligante para eliminar os protozoários simbióticos no intestino de cupins subterrâneos, faz parte do esforço para desenvolver técnicas alternativas de controle de cupins.Com menor dependência de produtos químicos na ausência dos simbiontes em seus intestinos, as térmitas morrem. Extraímos protozoários do intestino das térmitas para demonstrar que o ligante se liga aos protozoários e que o peptídeo lítico do ligante mata os protozoários. Partículas de madeira no interior dos protozoários apresentam autofluorescência. Portanto, é importante comparar os resultados dos protozoários tratados com ligante fluorescente aos protozoários não tratados.Para evitar falsos positivos, injetamos peptídeos diretamente no intestino posterior, pois se os peptídeos forem administrados aos cupins por via alimentar, as proteases do intestino médio e do intestino anterior os digerirão. Utilizando bibliotecas de exibição de fagos da New England Bio Labs, identificamos 19 sequências de peptídeos hep que se ligam a protozoários. Escolhemos um dos ligantes com uma sequência de peptídeos que apresentava semelhanças com glicoproteínas putativas conhecidas da membrana de Trypanosoma brucei.Após a síntese do peptídeo, acoplamos o peptídeo sintetizado a uma sonda fluorescente na extremidade C por meio de uma síntese peptídica em fase sólida utilizando a resina E-D-A-N-S novatech para avaliar as propriedades líticas dos conjugados peptídicos. Neste procedimento, utilizamos um conjugado do ligante sintetizado e do peptídeo lítico ate, que foi previamente sintetizado no laboratório de proteínas da LSU um dia antes da experimentação. Utilize sigma coat para tratar todos os materiais utilizados e prevenir a absorção de protozoários ou peptídeos nas superfícies.Aplicar uma camada uniforme e deixar secar durante a noite antes de usar no dia seguinte. Prepare uma caixa de ventilação dentro de uma câmara de luvas para circular continuamente o ar à temperatura ambiente através de um agente dessecante e pilhas de catalisador tipo D, reduzindo os níveis de umidade e oxigênio por mais de uma hora. Preencha a câmara de luvas com um fluxo contínuo de nitrogênio por 20 a 30 minutos e use nitrogênio adicional para manter as condições anaeróbicas quando necessário.Em seguida, prepare o meio Traeger U e ajuste o pH para sete. Espaçar o meio esterilizado por filtração na caixa de luvas por meio de uma ponteira de 200 microlitros ligada a um tubo com uma mistura de 2,5% de hidrogênio, 5% de dióxido de carbono e 92,5% de nitrogênio durante uma hora para remover resíduos de oxigênio na caixa de luvas. Quando os materiais estiverem prontos, use pinças para obter uma operária de cupim de uma placa de Petri e mergulhe todo o corpo em um béquer contendo 70% de etanol, segurando suavemente o cupim com as pinças por aproximadamente 10 segundos. Para remover contaminantes superficiais, retire a operária do etanol e deixe secar sobre uma toalha Kim limpa por cerca de 20 segundos.Dentro da câmara de luvas, prepare um lâmina de microscópio silanizada com 100 microlitros de meio Trager U para coletar o intestino da traça e um tubo com 900 microlitros de meio Trager U para coletar os protozoários. Em seguida, utilizando um microscópio estereoscópico e um par de pinças estéreis de ponta fina, segure o abdômen do indivíduo operário e agarre a ponta do abdômen com outro par de pinças para puxar suavemente o intestino para cima ou para baixo em um ângulo de 45 graus, tentando coletar o intestino médio e o intestino posterior em uma única peça. Coloque os intestinos das traças em uma gota de 100 microlitros de meio Trager U sobre uma lâmina de microscópio.Deslize o próximo, perfure os intestinos posteriores com um par de pinças estéreis finas para dissecação a fim de liberar os protozoários e transfira suavemente o conteúdo intestinal com uma pipeta de 200 microlitros para um tubo microcentrífugo de um mililitro contendo 900 microlitros de meio Traeger. Aguarde cinco segundos para a sedimentação dos fragmentos da parede intestinal e transfira 900 microlitros do sobrenadante para um tubo novo. Transfira os microlitros de cultura de protozoários para um microscópio com revestimento sigma.Deslize e verifique a condição dos protozoários sob um microscópio com ampliação de 200 vezes. Prepare culturas-controle de protozoários aeróbicos, tetra piriformis, ameba, ug, gleaner e paramecium, bem como uma cultura de e coli de um dia de duração no meio de cultura conforme recomendado pelo fornecedor, imediatamente após obter os protozoários. Fixe protozoários de intestino de térmita e quaisquer outros controles protozoários e e coli com formaldeído 10% a quatro graus Celsius por 12 horas. Em seguida, centrifugue a solução de protozoários a 30 vezes a gravidade por 10 minutos.Descarte o sobrenadante e lave o pellet contendo os protozoários fixados duas vezes com um mililitro de meio Trager U. Em seguida, ressuspender o pellet em um mililitro de meio Trager U e incubar os microrganismos fixados por uma a duas horas com 100 microlitros de uma solução de ligante sintetizado conjugado ao corante fluorescente E-D-A-N-S, utilizando uma concentração final de 50 micromolar de ligante dissolvido em água. Observe os microrganismos tratados com ligantes e os controles não tratados em microscópio de fluorescência com aumento de 400 vezes, com máximo de absorção em 341 nanômetros e emissão na região azul em 471 nanômetros.Para avaliar as propriedades litíticas do peptídeo conjugado ao ligante, pipete seis alíquotas de 198 microlitros de cultura de protozoários preparada conforme mostrado na seção três em tubos Eppendorf de 0,5 mililitro. Adicione dois microlitros de uma solução de 100 micromolar de peptídeo litítico com ligante à metade das alíquotas da cultura de protozoários do intestino de cupim. Para obter uma concentração final de um micromolar, adicione dois microlitros de água estéril como controle à outra metade das alíquotas.Após uma hora, transfira 10 microlitros de cada cultura de protozoários para uma lâmina. Compare a sobrevivência dos protozoários tratados com peptídeo lítico conjugado a ligante com a dos controles sob um microscópio com ampliação de 200 vezes, puxando as agulhas usando um puxador de micropipetas NGI PC com nível de calor em dois estágios. Para obter um tamanho de ponta entre 20 e 30 micrômetros, confirme o tamanho da ponta medindo-o ao microscópio.Usando um micrômetro, encha uma agulha com aproximadamente 30 microlitros de ligante marcado com fluorescência na concentração de 50 micromolar suspenso em água. Usando uma seringa acoplada, encha outra agulha com água para o controle. Fixe uma micropipeta a um suporte e a um micromanipulador. Fixe uma agulha ao suporte do sistema de injeção em um segundo micromanipulador.Defina os parâmetros iniciais de injeção para um comprimento de pulso de aproximadamente um segundo e uma injeção de 10 a 12 PSI. Em seguida, avance lentamente a agulha para dentro da micropipeta e injete a solução utilizando um pedal após a injeção. Remova a micropipeta e registre o comprimento da solução injetada.Usando um paquímetro, calcule o volume injetado a partir dos parâmetros conhecidos da micropipeta e ajuste a pressão e a duração do pulso para expelir 0,3 microlitros de solução. Em seguida, prepare 20 térmitas para cada tratamento a ser injetado. Primeiro, comprima suavemente a extremidade do abdômen com pinça macia para remover qualquer excreção presente no reto.Em seguida, imobilize as operárias de cupim resfriando-as em gelo por cinco minutos enquanto os cupins ficam imobilizados. Prepare recipientes para segurar as operárias de cupim cortando as ponteiras de pipetas de 100 microlitros. Usando uma lâmina de bisturi, corte a ponteira a um comprimento de 10 a 12 milímetros, conforme o tamanho dos cupins, e coloque-as em um frasco.Com uma tampa de rosca, fixe o receptor ao micromanipulador. Coloque uma operária em uma placa de Petri sobre seu lado dorsal e aspire a operária, de cabeça para dentro, para o receptor usando uma bomba de sucção de nitrogênio, de modo que a extremidade da operária fique projetada para fora do receptor. Segurando cuidadosamente o termite no receptor, avance a agulha cheia com o micromanipulador para inseri-la no ânus da operária. Injete 0,3 microlitros do ligante marcado com fluorescência ou controle de água.Coloque as operárias injetadas com ligante ou água em placas de Petri separadas contendo papel de filtro úmido e mantenha-as durante a noite a 26 graus Celsius com 78% de umidade relativa. Após 24 horas, eviscere os intestinos das térmitas injetadas e colete os protozoários conforme demonstrado anteriormente. Observe a ligação do ligante nos protozoários provenientes das térmitas injetadas utilizando microscopia de fluorescência para avaliar as propriedades líticas de peptídeos líticos conjugados ao ligante em térmitas vivas.Prepare os materiais para injeção, equipamentos e cupins conforme realizado anteriormente para injeções e injete 0,3 microlitros de uma solução de peptídeo lítico de ligante a 500 micromolar ou água como controle no intestino posterior de 20 operárias de cupim. Após 24 horas, retire intestinos adicionais de várias operárias e observe o conteúdo intestinal ao microscópio com aumento de 200 vezes assim que a morte de todos os protozoários no intestino do cupim tratado for confirmada. Mantenha os cupins tratados restantes e os controles em placas de Petri com papel de filtro úmido e observe a mortalidade diariamente. Confirmamos que o ligante conjugado a uma sonda fluorescente se liga às três espécies de protozoários, p grassi, h, heart, mani e sla.No intestino posterior de quatro mosquitos de cupins subterrâneos, em densidades indetectáveis, ocorre ligação do ligante em toda a superfície celular e esta se concentra na região anterior dos protozoários ao longo do eixo, próximo a uma lâmina de microtúbulos e ao núcleo MP olho de grama. Também detectamos fluorescência em todas as espécies de protozoários aeróbicos de vida livre testadas, o que sugere que o ligante se liga a estruturas genéricas dos protozoários. Embora nenhuma ligação do ligante tenha sido observada para *E. coli*, um micromolar do peptídeo lítico ligante matou as três espécies de protozoários do intestino de cupins operários de *omo* e subterrâneos, bem como o protozoário de vida livre *Tetrahymena piriformis* *in vitro* em menos de 10 minutos, enquanto os controles permaneceram vivos.Esta imagem mostra a perda progressiva da integridade da membrana dos protozoários intestinais de cupins tratados com peptídeo lítico ligado a ligante. Nenhuma diferença foi observada no número de colônias de E. coli entre os tratamentos com peptídeo lítico ligado a ligante e água; no entanto, o peptídeo lítico sem ligante reduziu consideravelmente o número de colônias de E. coli. Isso sugere que a ligação de um ligante ao peptídeo lítico protege, até certo ponto, micro-organismos não alvo da lise. A injeção de 0,3 microlitros de peptídeo lítico ligado a ligante a 500 micromolar matou as três espécies de protozoários no intestino de cupins de madeira seca e subterrâneos dentro de 24 horas, e os cupins morreram após 10 dias quando o peptídeo lítico conjugado a ligante foi injetado.Protozoários e térmitas morreram três vezes mais rápido do que quando peptídeos líticos não conjugados a ligantes foram injetados, conforme demonstrado em Husen e Colia, 2009, sugerindo que o ligante aumenta a eficiência citocida dos peptídeos líticos sobre protozoários em condições ótimas de cultivo. Todas as três espécies de proa extraídas do intestino de Omo. Térmitas subterrâneas devem permanecer vivas e saudáveis por pelo menos três dias.No entanto, se houver resíduos de oxigênio no meio, o movimento dos protozoários para imediatamente. Se o meio incorreto for utilizado e a pressão osmótica nas células ficar muito alta, as membranas dos protozoários incham e os protozoários se rompem. Se a pressão osmótica nas células ficar muito baixa ou as membranas estiverem comprometidas, os protozoários murcharão e encolherão. A fixação de protozoários facilita a detecção da ligação de ligantes fluorescentes acoplados aos protozoários.É difícil detectar a fluorescência e distingui-la da autofluorescência das partículas de madeira quando os protozoários estão se movendo livremente. Uma vez dominada esta técnica, aproximadamente 30 térmitas por hora podem ser injetados com a ajuda de um assistente. Embora o peptídeo colítico ligante tenha sido desenvolvido para eliminar a simbiose de protossomos no intestino de térmitas subterrâneos e, portanto, para o controle de térmitas, ele também poderia ser útil para o desenvolvimento de medicamentos contra parasitas protossomos, como slash mania, ponoma, te e odium, que causam diversas doenças em humanos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter e manter protozoários extraídos do intestino de térmitas em cultura, como demonstrar a ligação específica de um ligante aos protozoários por meio de microscopia de fluorescência, como mostrar a ação citotóxica específica de um peptídeo ligante contra protozoários in vitro. E, por último, mas não menos importante, como injetar peptídeos no intestino do termo para confirmação in vivo.

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Biology

Biologia

Este vídeo ilustra a técnica para a extração de DNA das espécies de micróbios residentes no intestino posterior de cupins. A preparação de uma lâmina de montagem molhada, o que é útil para visualizar a comunidade microbiana do intestino também é ilustrado, e um tour pela espécie ambiente rico intestino é dado.

Extração de DNA a partir do Micróbios Gut da térmita (Zootermopsis Angusticollis) e Visualizing micróbios do intestino

Jared Leadbetter explica por que a comunidade microbiana do intestino de cupins é um excelente sistema para estudar as complexas interações entre os micróbios. A relação simbiótica existente entre o inseto hospedeiro e de degradação de lignocelulose micróbios do intestino é explicado, bem como os usos industriais desses micróbios de biomassa vegetal e de biocombustíveis gerando degradante.

Investigando a comunidade microbiana no intestino grosso da térmita - Entrevista

Jared Leadbetter nos leva para um passeio pela natureza através da diversidade de vida residentes no intestino grosso de cupim - um microambiente contendo 250 espécies diferentes encontradas em nenhum outro lugar na Terra. Jared revela que a simbiose exibida por este sistema é multi-camadas e envolve não apenas uma relação entre os cupins e seus habitantes intestino, mas também envolve uma complexa rede de simbiose entre os micróbios do intestino si.

Camadas de Simbiose - Visualizando a térmita comunidade microbiana do intestino posterior

Um método simples e geral para a síntese de peptídeos cíclicos usando irradiação de microondas é descrito. Este procedimento permite a síntese de peptídeos cíclicos de backbone com uma coleção de diferentes conformações, mantendo as cadeias laterais e as porções farmacofóricas., e, portanto, permite rastrear a conformação bioativa.

Desenvolvimento de um Backbone cíclica Biblioteca de Peptídeos como potencial antiparasitário Therapeutics Usando Microondas Irradiação

Um protocolo para sintetizar peptóides com funcionalidade catiônica mista na mesma sequência é apresentado (monômeros do tipo lisina e arginina). Testes subsequentes desses compostos contra Leishmania mexicana, os protozoários parasitas causadores da leishmaniose cutânea, também são descritos.

Um método eficiente para a Síntese de Peptóides com Monómeros Mixed tipo de lisina / arginina-tipo e avaliação da sua actividade anti-leishmaniose

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Descrevemos um ensaio colorimétrico de alta produtividade medindo β-galactosidase atividade em três estágios do ciclo de vida de Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas. Este ensaio pode ser usado para identificar compostos trypanocidas de forma fácil, rápida e reprodutível.

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Colônias fúngicas entomopatômicas são isoladas de amostras de solo tropical usando isca tenebrio , isca de Galleria , bem como meio artificial seletivo, ou seja, ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, tiaabzolendae e ciclohexmida (meio CTC).

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Atividade de testes Protozoacidal Ligand-lítica Peptídeos Contra Gut Termite Protozoa In vitro (Cultura Protozoa) e In vivo (Microinjeção em Termite intestino grosso) (Vídeo) | JoVE Journal

Atividade de testes Protozoacidal Ligand-lítica Peptídeos Contra Gut Termite Protozoa In vitro (Cultura Protozoa) e In vivo (Microinjeção em Termite intestino grosso)

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