Atividade de testes Protozoacidal Ligand-lítica Peptídeos Contra Gut Termite Protozoa In vitro (Cultura Protozoa) e In vivo (Microinjeção em Termite intestino grosso)

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar que um ligante sintetizado se liga especificamente aos protozoários digestores de celulose no intestino de térmitas subterrâneas do gênero *form mosen*, e que o ligante conjugado com um peptídeo lítico mata esses protozoários *in vitro* em culturas anaeróbicas de protozoários e *in vivo* por injeção no intestino posterior do termite. Isso é realizado primeiramente pela extração de protozoários do intestino de térmitas operárias sob condições anaeróbicas. O segundo passo do procedimento é confirmar a ligação de um ligante conjugado com um fluoróforo aos protozoários do intestino de térmitas *in vitro*.

O terceiro passo do procedimento consiste em demonstrar que o peptídeo lítico conjugado ao ligante mata os protozoários do intestino de cupim in vitro. O passo final do procedimento é injetar o ligante conjugado a um fluoróforo e o peptídeo lítico conjugado ao ligante no intestino posterior do cupim para confirmar a ligação e a destruição dos protozoários intestinais in vivo. Utilizando injeções de culturas de protozoários no intestino posterior do cupim e microscopia de fluorescência, demonstramos que um ligante conjugado a um peptídeo lítico se liga e mata eficientemente os protozoários do intestino de cupim in vitro e in vivo.

A ligação do ligante ao peptídeo lítico aumentou a toxicidade para protozoários em comparação com o peptídeo lítico isolado. Embora tenha reduzido a toxicidade para organismos não alvo, como *E. coli*, muito provavelmente porque o ligante não se ligou à membrana celular bacteriana, a perda de protozoários leva à morte dos cupins em menos de duas semanas. A técnica apresentada, que utiliza peptídeos colíticos com ligante para eliminar os protozoários simbióticos no intestino de cupins subterrâneos, faz parte do esforço para desenvolver técnicas alternativas de controle de cupins.

Com menor dependência de produtos químicos na ausência dos simbiontes em seus intestinos, as térmitas morrem. Extraímos protozoários do intestino das térmitas para demonstrar que o ligante se liga aos protozoários e que o peptídeo lítico do ligante mata os protozoários. Partículas de madeira no interior dos protozoários apresentam autofluorescência. Portanto, é importante comparar os resultados dos protozoários tratados com ligante fluorescente aos protozoários não tratados.

Para evitar falsos positivos, injetamos peptídeos diretamente no intestino posterior, pois se os peptídeos forem administrados aos cupins por via alimentar, as proteases do intestino médio e do intestino anterior os digerirão. Utilizando bibliotecas de exibição de fagos da New England Bio Labs, identificamos 19 sequências de peptídeos hep que se ligam a protozoários. Escolhemos um dos ligantes com uma sequência de peptídeos que apresentava semelhanças com glicoproteínas putativas conhecidas da membrana de Trypanosoma brucei.

Após a síntese do peptídeo, acoplamos o peptídeo sintetizado a uma sonda fluorescente na extremidade C por meio de uma síntese peptídica em fase sólida utilizando a resina E-D-A-N-S novatech para avaliar as propriedades líticas dos conjugados peptídicos. Neste procedimento, utilizamos um conjugado do ligante sintetizado e do peptídeo lítico ate, que foi previamente sintetizado no laboratório de proteínas da LSU um dia antes da experimentação. Utilize sigma coat para tratar todos os materiais utilizados e prevenir a absorção de protozoários ou peptídeos nas superfícies.

Aplicar uma camada uniforme e deixar secar durante a noite antes de usar no dia seguinte. Prepare uma caixa de ventilação dentro de uma câmara de luvas para circular continuamente o ar à temperatura ambiente através de um agente dessecante e pilhas de catalisador tipo D, reduzindo os níveis de umidade e oxigênio por mais de uma hora. Preencha a câmara de luvas com um fluxo contínuo de nitrogênio por 20 a 30 minutos e use nitrogênio adicional para manter as condições anaeróbicas quando necessário.

Em seguida, prepare o meio Traeger U e ajuste o pH para sete. Espaçar o meio esterilizado por filtração na caixa de luvas por meio de uma ponteira de 200 microlitros ligada a um tubo com uma mistura de 2,5% de hidrogênio, 5% de dióxido de carbono e 92,5% de nitrogênio durante uma hora para remover resíduos de oxigênio na caixa de luvas. Quando os materiais estiverem prontos, use pinças para obter uma operária de cupim de uma placa de Petri e mergulhe todo o corpo em um béquer contendo 70% de etanol, segurando suavemente o cupim com as pinças por aproximadamente 10 segundos. Para remover contaminantes superficiais, retire a operária do etanol e deixe secar sobre uma toalha Kim limpa por cerca de 20 segundos.

Dentro da câmara de luvas, prepare um lâmina de microscópio silanizada com 100 microlitros de meio Trager U para coletar o intestino da traça e um tubo com 900 microlitros de meio Trager U para coletar os protozoários. Em seguida, utilizando um microscópio estereoscópico e um par de pinças estéreis de ponta fina, segure o abdômen do indivíduo operário e agarre a ponta do abdômen com outro par de pinças para puxar suavemente o intestino para cima ou para baixo em um ângulo de 45 graus, tentando coletar o intestino médio e o intestino posterior em uma única peça. Coloque os intestinos das traças em uma gota de 100 microlitros de meio Trager U sobre uma lâmina de microscópio.

Deslize o próximo, perfure os intestinos posteriores com um par de pinças estéreis finas para dissecação a fim de liberar os protozoários e transfira suavemente o conteúdo intestinal com uma pipeta de 200 microlitros para um tubo microcentrífugo de um mililitro contendo 900 microlitros de meio Traeger. Aguarde cinco segundos para a sedimentação dos fragmentos da parede intestinal e transfira 900 microlitros do sobrenadante para um tubo novo. Transfira os microlitros de cultura de protozoários para um microscópio com revestimento sigma.

Deslize e verifique a condição dos protozoários sob um microscópio com ampliação de 200 vezes. Prepare culturas-controle de protozoários aeróbicos, tetra piriformis, ameba, ug, gleaner e paramecium, bem como uma cultura de e coli de um dia de duração no meio de cultura conforme recomendado pelo fornecedor, imediatamente após obter os protozoários. Fixe protozoários de intestino de térmita e quaisquer outros controles protozoários e e coli com formaldeído 10% a quatro graus Celsius por 12 horas. Em seguida, centrifugue a solução de protozoários a 30 vezes a gravidade por 10 minutos.

Descarte o sobrenadante e lave o pellet contendo os protozoários fixados duas vezes com um mililitro de meio Trager U. Em seguida, ressuspender o pellet em um mililitro de meio Trager U e incubar os microrganismos fixados por uma a duas horas com 100 microlitros de uma solução de ligante sintetizado conjugado ao corante fluorescente E-D-A-N-S, utilizando uma concentração final de 50 micromolar de ligante dissolvido em água. Observe os microrganismos tratados com ligantes e os controles não tratados em microscópio de fluorescência com aumento de 400 vezes, com máximo de absorção em 341 nanômetros e emissão na região azul em 471 nanômetros.

Para avaliar as propriedades litíticas do peptídeo conjugado ao ligante, pipete seis alíquotas de 198 microlitros de cultura de protozoários preparada conforme mostrado na seção três em tubos Eppendorf de 0,5 mililitro. Adicione dois microlitros de uma solução de 100 micromolar de peptídeo litítico com ligante à metade das alíquotas da cultura de protozoários do intestino de cupim. Para obter uma concentração final de um micromolar, adicione dois microlitros de água estéril como controle à outra metade das alíquotas.

Após uma hora, transfira 10 microlitros de cada cultura de protozoários para uma lâmina. Compare a sobrevivência dos protozoários tratados com peptídeo lítico conjugado a ligante com a dos controles sob um microscópio com ampliação de 200 vezes, puxando as agulhas usando um puxador de micropipetas NGI PC com nível de calor em dois estágios. Para obter um tamanho de ponta entre 20 e 30 micrômetros, confirme o tamanho da ponta medindo-o ao microscópio.

Usando um micrômetro, encha uma agulha com aproximadamente 30 microlitros de ligante marcado com fluorescência na concentração de 50 micromolar suspenso em água. Usando uma seringa acoplada, encha outra agulha com água para o controle. Fixe uma micropipeta a um suporte e a um micromanipulador. Fixe uma agulha ao suporte do sistema de injeção em um segundo micromanipulador.

Defina os parâmetros iniciais de injeção para um comprimento de pulso de aproximadamente um segundo e uma injeção de 10 a 12 PSI. Em seguida, avance lentamente a agulha para dentro da micropipeta e injete a solução utilizando um pedal após a injeção. Remova a micropipeta e registre o comprimento da solução injetada.

Usando um paquímetro, calcule o volume injetado a partir dos parâmetros conhecidos da micropipeta e ajuste a pressão e a duração do pulso para expelir 0,3 microlitros de solução. Em seguida, prepare 20 térmitas para cada tratamento a ser injetado. Primeiro, comprima suavemente a extremidade do abdômen com pinça macia para remover qualquer excreção presente no reto.

Em seguida, imobilize as operárias de cupim resfriando-as em gelo por cinco minutos enquanto os cupins ficam imobilizados. Prepare recipientes para segurar as operárias de cupim cortando as ponteiras de pipetas de 100 microlitros. Usando uma lâmina de bisturi, corte a ponteira a um comprimento de 10 a 12 milímetros, conforme o tamanho dos cupins, e coloque-as em um frasco.

Com uma tampa de rosca, fixe o receptor ao micromanipulador. Coloque uma operária em uma placa de Petri sobre seu lado dorsal e aspire a operária, de cabeça para dentro, para o receptor usando uma bomba de sucção de nitrogênio, de modo que a extremidade da operária fique projetada para fora do receptor. Segurando cuidadosamente o termite no receptor, avance a agulha cheia com o micromanipulador para inseri-la no ânus da operária. Injete 0,3 microlitros do ligante marcado com fluorescência ou controle de água.

Coloque as operárias injetadas com ligante ou água em placas de Petri separadas contendo papel de filtro úmido e mantenha-as durante a noite a 26 graus Celsius com 78% de umidade relativa. Após 24 horas, eviscere os intestinos das térmitas injetadas e colete os protozoários conforme demonstrado anteriormente. Observe a ligação do ligante nos protozoários provenientes das térmitas injetadas utilizando microscopia de fluorescência para avaliar as propriedades líticas de peptídeos líticos conjugados ao ligante em térmitas vivas.

Prepare os materiais para injeção, equipamentos e cupins conforme realizado anteriormente para injeções e injete 0,3 microlitros de uma solução de peptídeo lítico de ligante a 500 micromolar ou água como controle no intestino posterior de 20 operárias de cupim. Após 24 horas, retire intestinos adicionais de várias operárias e observe o conteúdo intestinal ao microscópio com aumento de 200 vezes assim que a morte de todos os protozoários no intestino do cupim tratado for confirmada. Mantenha os cupins tratados restantes e os controles em placas de Petri com papel de filtro úmido e observe a mortalidade diariamente. Confirmamos que o ligante conjugado a uma sonda fluorescente se liga às três espécies de protozoários, p grassi, h, heart, mani e sla.

No intestino posterior de quatro mosquitos de cupins subterrâneos, em densidades indetectáveis, ocorre ligação do ligante em toda a superfície celular e esta se concentra na região anterior dos protozoários ao longo do eixo, próximo a uma lâmina de microtúbulos e ao núcleo MP olho de grama. Também detectamos fluorescência em todas as espécies de protozoários aeróbicos de vida livre testadas, o que sugere que o ligante se liga a estruturas genéricas dos protozoários. Embora nenhuma ligação do ligante tenha sido observada para *E. coli*, um micromolar do peptídeo lítico ligante matou as três espécies de protozoários do intestino de cupins operários de *omo* e subterrâneos, bem como o protozoário de vida livre *Tetrahymena piriformis* *in vitro* em menos de 10 minutos, enquanto os controles permaneceram vivos.

Esta imagem mostra a perda progressiva da integridade da membrana dos protozoários intestinais de cupins tratados com peptídeo lítico ligado a ligante. Nenhuma diferença foi observada no número de colônias de E. coli entre os tratamentos com peptídeo lítico ligado a ligante e água; no entanto, o peptídeo lítico sem ligante reduziu consideravelmente o número de colônias de E. coli. Isso sugere que a ligação de um ligante ao peptídeo lítico protege, até certo ponto, micro-organismos não alvo da lise. A injeção de 0,3 microlitros de peptídeo lítico ligado a ligante a 500 micromolar matou as três espécies de protozoários no intestino de cupins de madeira seca e subterrâneos dentro de 24 horas, e os cupins morreram após 10 dias quando o peptídeo lítico conjugado a ligante foi injetado.

Protozoários e térmitas morreram três vezes mais rápido do que quando peptídeos líticos não conjugados a ligantes foram injetados, conforme demonstrado em Husen e Colia, 2009, sugerindo que o ligante aumenta a eficiência citocida dos peptídeos líticos sobre protozoários em condições ótimas de cultivo. Todas as três espécies de proa extraídas do intestino de Omo. Térmitas subterrâneas devem permanecer vivas e saudáveis por pelo menos três dias.

No entanto, se houver resíduos de oxigênio no meio, o movimento dos protozoários para imediatamente. Se o meio incorreto for utilizado e a pressão osmótica nas células ficar muito alta, as membranas dos protozoários incham e os protozoários se rompem. Se a pressão osmótica nas células ficar muito baixa ou as membranas estiverem comprometidas, os protozoários murcharão e encolherão. A fixação de protozoários facilita a detecção da ligação de ligantes fluorescentes acoplados aos protozoários.

É difícil detectar a fluorescência e distingui-la da autofluorescência das partículas de madeira quando os protozoários estão se movendo livremente. Uma vez dominada esta técnica, aproximadamente 30 térmitas por hora podem ser injetados com a ajuda de um assistente. Embora o peptídeo colítico ligante tenha sido desenvolvido para eliminar a simbiose de protossomos no intestino de térmitas subterrâneos e, portanto, para o controle de térmitas, ele também poderia ser útil para o desenvolvimento de medicamentos contra parasitas protossomos, como slash mania, ponoma, te e odium, que causam diversas doenças em humanos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter e manter protozoários extraídos do intestino de térmitas em cultura, como demonstrar a ligação específica de um ligante aos protozoários por meio de microscopia de fluorescência, como mostrar a ação citotóxica específica de um peptídeo ligante contra protozoários in vitro. E, por último, mas não menos importante, como injetar peptídeos no intestino do termo para confirmação in vivo.